基于集成型微流控芯片的细菌快速检测及药敏分析

摘要

目的:感染性疾病，尤其是细菌感染，是临床上导致患者死亡的主要原因之一，而95％以上是由于缺乏及时的诊断和治疗。但常规的病原菌鉴定和药敏分析方法都存在操作繁琐，周期长(24～72h)，费时费力等缺陷，不能满足临床上对感染性疾病早期诊断和及时、有效治疗的需求。因此，发展一种既能灵敏、快速地检测病原菌，又能及时提供有效的抗生素信息的新方法（平台）刻不容缓。微流控芯片，以其规模化集成、高通量检测、反应速度快、试剂耗费少等优势从根本上弥补了传统方法的不足。尤其是利用微流控芯片“能集成常规实验室中多项分析于一体”这一特点，能为临床医生和患者同时提供多项与感染病菌相关的检测结果。本实验目的在于充分利用微流控芯片技术集成化这一特点，构建一个“既适于病原菌快速鉴定，又适于同步进行感染病原菌药敏检测”的联合检测平台，以期为临床感染性疾病的早期诊断和有效治疗提供一种更快速、有效的检测方法。
　　方法:本研究中所构建的微流控芯片包括4个单元，分别为单元a、b、c和d。单元a用于对样本中病菌的检测，其余3个平行芯片单元用于所感染病菌的平行药敏分析。其中，单元a通过一个填充有特异抗体修饰的微珠“捕获腔”对待检细菌进行特异地、高效率地捕获，然后对所被捕获的细菌进行在线荧光检测，并根据荧光强度进行定量分析;而单元b、c、d均由混合室、浓度发生器及监测室组成。首先，向混合室内灌注样本液;随后，抗生素经浓度发生器产生不同浓度，持续作用于混合室内的细菌;最后，监测室内的细菌经活菌染色、成像分析与统计得到最终的药敏结果。
　　本实验以E.coli O157为检测目标，首先在微珠表面修饰针对目的菌的特异性抗体，再将该免疫微珠填充于芯片单元a中的捕获腔内，随后将E.coli O157菌液注入单元a，并使其流经捕获腔，菌液中E.coli O157在此被捕获/富集，再采用免疫荧光法对富集到的细菌进行在线检测，根据荧光强度进行定量分析，同时与传统的平板计数法(PCM)所得的结果进行比较。接下来对微流控芯片单元a检测的灵敏性、准确性和特异性进行评估。然后，将上述E.coli O157菌液分别注入单元b、c、d的混合室内，研究头孢曲松、诺氟沙星及氨苄西林对E.coli O157的抗菌效应。作为对照，采用大平台的96孔板进行药敏检测，比较两种平台下监测到的细胞生存状态，验证用芯片单元b、c、d进行药敏检测的可行性。
　　结果:本实验成功地设计了一个集“细菌快速检测和药敏分析”于“一体”的微流控芯片联合检测平台。利用芯片单元a，实现了在30 min内对1ul样本中E.coliO157的检测，其检测限度为101-105 CFU/μL，同时通过荧光定量分析成功建立了细菌数量-荧光强度关系曲线。通过对混合菌的检测，进一步验证了芯片检测单元对E.coliO157的特异性。在芯片单元b，c和d中，其浓度梯度发生器成功自动产生了0∶1∶2∶3∶4的药物浓度，并在4-8 h内完成了E.coli O157在三种不同抗生素、不同浓度作用下的药敏分析。同时证明无论是病原菌检测，或是药敏分析，该微流控芯片平台上所得结果与大平台上所得结果一致。
　　结论:本实验建立的以微珠为基础的集成型微流控芯片在适于病原体的快速检测和药敏分析的同时，兼具良好的灵敏性、特异性及可靠性。其最大的特色在于大幅度缩短了检测所需时间，实现了多项分析的“一体化”。