STAT3在H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤发生发展中的作用机制研究

摘要

目的:
　　探究STAT3在ras癌基因诱导的肝肿瘤发生发展中的作用机制。
　　方法:
　　1.提取9月龄H-ras12V转基因雄鼠肝肿瘤组织(T)、肿瘤周围组织(P)以及9月龄非转基因雄鼠肝组织(Wt)样本，经病理确认后，提取总蛋白质和总RNA;提取人正常肝细胞株L-O2和人肝癌细胞株Hep3B的总蛋白质和总RNA;应用蛋白质印迹法检测组织和细胞样本中p-ERK、ERK、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3的蛋白水平;荧光定量PCR检测STAT3下游靶基因pik3r1在组织和细胞样本中的mRNA表达水平。
　　2.用抑制剂LY294002、PD184352和Rapamycin（RAPA）分别抑制Hep3B细胞的PI3K/AKT、ERK和mTOR信号通路活性，在抑制后3，6和12h提取总蛋白质，检测抑制剂对STAT3蛋白及其磷酸化水平的影响，在抑制后6，12和18h提取总RNA，检测抑制剂对STAT3的下游靶基因pik3r1 mRNA水平的影响。
　　结果:
　　1.p-ERK的蛋白水平检测表明:T组织中的p-ERK蛋白水平为22.09±6.57，与Wt组织的0.08±0.02相比显著升高(t=5.80，P=0.004)，与P组织的8.60±3.23相比也显著升高(t=3.19，P=0.033)，P组织比Wt组织显著升高（t=4.57，P=0.045）;细胞水平检测结果显示，人肝癌细胞系Hep3B中的p-ERK水平为人正常肝细胞系L-O2的10.87倍。ERK的蛋白水平检测表明:T组织中的ERK蛋白水平为16.39±3.40，与Wt组织的5.27±1.43相比显著升高（t=4.20，P=0.025），与P组织的4.76±1.79相比也显著升高(t=5.24，P=0.006);细胞水平检测结果显示，人肝癌细胞系Hep3B中的ERK水平为人正常肝细胞系L-O2的24.77倍。p-PI3K的蛋白水平检测结果表明:T组织中的p-PI3K蛋白水平为0.45±0.04，与Wt组织的0.06±0.00相比显著升高（t=8.12，P=0.004），与P组织的0.23±0.04相比也显著升高(t=4.12，P=0.015)，P组织比Wt组织显著升高（t=3.32，P=0.045）;细胞水平检测结果显示，p-PI3K水平在人正常肝细胞系L-O2和人肝癌细胞系Hep3B中没有显著差异。PI3K的蛋白水平检测结果表明:T组织中的PI3K蛋白水平为0.87±0.13，与Wt组织的0.03±0.00相比显著升高(t=10.56，P＜0.001)，与P组织的0.28±0.09相比也显著升高（t=3.96，P=0.029），P组织比Wt组织显著升高（t=3.43，P=0.019）;细胞水平检测结果显示，人正常肝细胞系L-O2中的PI3K水平为人肝癌细胞系Hep3B的500倍。p-AKT的蛋白水平检测结果表明:T组织中的p-AKT蛋白水平为0.69±0.04，与Wt组织的0.10±0.02相比显著升高(t=22.90，P＜0.001)，与P组织的0.08±0.03相比也显著升高(t=21.58，P＜0.001);细胞水平检测结果显示，人肝癌细胞系Hep3B中的p-AKT水平为人正常肝细胞系L-O2的6.77倍。AKT的蛋白水平检测结果表明:T组织中的AKT蛋白水平为0.19±0.04，与Wt组织的0.08±0.05相比显著升高（t=2.96，P=0.041），P组织中的AKT蛋白水平为0.25±0.04，与Wt组织的相比也显著升高(t=4.38，P=0.012);细胞水平检测结果显示，人肝癌细胞系Hep3B中的AKT水平为人正常肝细胞系L-O2的6.75倍。p-mTOR的蛋白水平检测结果表明:T组织中的p-mTOR蛋白水平为0.44±0.02，与Wt组织的0.14±0.03相比显著升高(t=14.36，P＜0.001)，与P组织的0.16±0.04相比也显著升高（t=10.51，P＜0.001）;细胞水平检测结果显示，人肝癌细胞系Hep3B中的p-mTOR水平为人正常肝细胞系L-O2的21.74倍。mTOR的蛋白水平检测结果表明:mTOR的表达水平在Wt（0.18±0.06）、P（0.35±0.27）和T（0.61±0.67）之间没有显著差异;细胞水平检测结果显示，人正常肝细胞系L-O2中的mTOR水平为人肝癌细胞系Hep3B的5倍。p-STAT3的蛋白水平检测结果表明:Wt组织中的p-STAT3蛋白水平为42.87±9.36，与T组织的4.27±0.72相比显著升高（t=4.119，P=0.015），P组织中的p-STAT3蛋白水平为32.47±3.21，与T组织的相比也显著升高(t=8.73，P=0.001);细胞水平检测结果显示，人正常肝细胞系L-O2中的p-STAT3水平为人肝癌细胞系Hep3B的10倍。STAT3的蛋白水平检测结果表明:Wt（25.81±8.97）、P（27.81±0.61）和T（26.67±0.43）中STAT3的水平没有显著差异;细胞水平检测结果显示，人正常肝细胞系L-O2中的STAT3水平为人肝癌细胞系Hep3B的2倍。荧光定量PCR检测结果显示，与Wt相比，STAT3的靶基因pik3r1 mRNA水平在P、T中显著降低(P＜0.01);细胞水平检测结果显示，同L-O2相比，pik3r1 mRNA水平在Hep3B中显著降低(P＜0.001)。
　　2.抑制实验结果显示:应用LY294002抑制剂后，与对照组相比，随着抑制时间的延长，p-AKT的水平逐渐降低，表明AKT的活化水平被有效抑制，与AKT的活化水平降低相反，p-STAT3水平明显升高;应用PD184352抑制剂后，与对照组相比，p-ERK水平几乎检测不到，表明ERK的活化水平被有效抑制，与ERK的活化水平降低相一致，p-STAT3水平也明显降低;应用RAPA抑制剂后，与对照组相比，在3h，p-mTOR水平明显升高，与之相反，p-STAT3水平明显降低，在6h，二者均没有显著变化，在12h，p-mTOR水平明显降低，与之相反，p-STAT3水平明显升高。应用LY294002和PD184352抑制剂后，同正常对照组相比，pik3r1mRNA水平在6h，12h明显升高，在18h又恢复到正常水平。应用RAPA抑制剂后，同正常对照组相比，pik3r1 mRNA水平在6h没有明显变化，在12和18h明显升高。
　　结论:
　　体内检测结果表明，在肝肿瘤发生发展的过程中，ras信号通路的激活直接诱导了p-STAT3及其下游靶基因pik3r1 mRNA水平的降低，提示STAT3可能具有抑制肝肿瘤发生发展的作用。体外检测结果也显示STAT3可能具有抑制人肝癌细胞株Hep3B的作用。抑制实验的结果表明，在Hep3B细胞中，ERK通路的活化能激活STAT3;而PI3K/AKT及mTOR通路对STAT3的活性可能起到抑制作用。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

1．病理分析

2．ERK蛋白的表达水平及磷酸化水平的变化

3．PI3K蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

4．AKT蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

5．mTOR蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

6．STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

7．STAT3下游靶基因pik3r1 mRNA水平的变化

8．体外细胞系中ERK蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

9．体外细胞系中PI3K蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

10．体外细胞系中AKT蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

11．体外细胞系中mTOR蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

12．体外细胞系中STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平的变化

13．体外细胞系中pik3r1 mRNA水平的变化

14．PI3K、ERK、mTOR抑制剂对STAT3水平的影响

15．PI3K、ERK、mTOR抑制剂对pik3r1 mRNA水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述 STAT3信号分子与肝肿瘤发生

攻读学位期间发表论文情况

致谢