泛素-蛋白酶体抑制剂对左室肥厚离子通道的影响和rs3807989与房颤的相关性研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 泛素-蛋白酶体抑制剂对左室肥厚及离子通道的影响
　　背景:左室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是心脏为适应前后负荷增加而产生的左室心肌细胞体积增大，重量增加，可继发于很多疾病，如常见的高血压、心肌梗死、先天性心脏病及瓣膜病等。左室肥厚不仅引发心脏收缩舒张功能不全，且可导致心脏多种电生理异常，是心律失常的重要危险因素之一，其所致心室动作电位延长、复极离散度发生改变，可引起室速等致命性心律失常的发生率显著增加。房性和室性心律失常是左室肥厚的常见并发症。左室肥厚致心律失常的机制尚不明确，很多研究发现左室肥厚模型中钙、钾离子通道表达存在改变，提示离子通道改变与左室肥厚致心律失常有关。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitinproteasome system，UPS)主要由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)和26S蛋白酶体组成。UPS降解细胞内高达80-90％泛素化的蛋白质，其不仅是清除损伤及陈旧蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节炎症、细胞凋亡、细胞增生与分化及DNA修复等各种细胞生物学功能。早先研究UPS与肿瘤及自身免疫疾病有密切关系，现有学者研究发现泛素-蛋白酶体与冠心病、心肌病及心力衰竭等心血管疾病均有关，但UPS在左室肥厚及心律失常中的作用目前尚不明确。
　　目的:分别用主动脉缩窄法(transverse aortic constriction，TAC)及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ，2000ng/kg/min）微量灌注法建立野生小鼠LVH模型，检测左心室组织中钙离子和钾离子通道表达的改变，并观察泛素-蛋白酶抑制剂PYR-41、PR-957对LVH及离子通道的影响。
　　方法:取野生C57BL/6小鼠为研究对象，分别采用TAC(2W，4W)方法及AngⅡ(2000ng/kg/min)3周持续微量灌注法建立野生小鼠LVH模型，无创鼠尾套管血压仪监测小鼠血压，彩超检测小鼠心脏左心室前壁及后壁厚度、左心室收缩及舒张末期容积，计算左心室射血分数和缩短分数，H&E染色检测组织炎性细胞浸润，采用Masson Trichrome染色及实时定量PCR分析(qPCR)检测胶原Ⅰ型(collagenⅠ)和胶原Ⅲ型(collagenⅢ)的mRNA表达水平评估心脏纤维化，WGA染色计算心肌纤维横截面积，实时定量PCR分析(qPCR)检测BNP及β-MHC表达水平以评估心肌肥厚，Western blot及qPCR方法检测肥厚心肌中心室钙离子和钾离子通道表达水平改变。AngⅡ3周持续微量灌注法建立小鼠左室肥厚模型并设计分组，分别加用PYR-41（E1抑制剂）及PR-957（β5i抑制剂），观察泛素-蛋白酶抑制剂对左室肥厚及离子通道的影响。
　　结果:1、与假手术组相比，TAC2周及4周小鼠模型的心脏/体重比、左室前壁及后壁厚度、心肌纤维横截面积显著增加。TAC4周小鼠射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)较假手术组显著下降。Western blot分析发现与假手术组相比，TAC2周及4周小鼠心室组织中SERCA2、CASQ2、KIR3.4、KIR2.1蛋白表达水平均降低，CACNA1C蛋白表达水平升高;其中SERCA2、KIR3.4的蛋白表达降低与CACNA1C蛋白表达水平升高有统计学差异。
　　2、与生理盐水组相比，AngⅡ灌注3周后野生小鼠血压明显升高、心/重比明显增加，左室前壁及后壁厚度、心肌纤维横截面积显著增加，两组间有统计学差异。AngⅡ灌注组射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)轻度上升。实时定量PCR分析(qPCR)显示AngⅡ灌注组小鼠左室组织中BNP及β-MHC表达水平显著升高。Western blot及qPCR分析发现与生理盐水组相比，AngⅡ灌注组小鼠左室组织中SERCA2、CASQ2、RyR2、CACNA1C、KCNQ1及KIR3.4蛋白及mRNA表达水平均降低，KIR2.1蛋白及mRNA表达水平均略上升，其中SERCA2、CASQ2及KIR3.4的表达降低有统计学差异。
　　3、与AngⅡ+DMSO组相比，AngⅡ+PYR-41组小鼠的心重比、左室前壁及左室后壁厚度明显降低，差别有显著性意义(P＜0.05);与AngⅡ+DMSO组相比，AngⅡ+PYR-41组小鼠左室组织SERCA2及KIR3.4蛋白的表达水平均有升高，但无显著性差异。
　　4、与AngⅡ+DMSO组相比，AngⅡ+PR-957组小鼠的左室前壁厚度显著降低(P＜0.05)，心重比及左室后壁厚度也呈降低趋势，但无统计学意义。与AngⅡ+DMSO组相比，AngⅡ+PR-957组小鼠左心室组织SERCA2蛋白基本无变化，KIR3.4蛋白的表达水平有所升高，但无显著性差异。
　　结论:TAC(2W，4W)方法及AngⅡ(2000ng/kg/min)3周持续微量灌注法可成功建立小鼠左室肥厚模型，并伴有多种钙离子和钾离子通道表达水平改变。其中SERCA2、KIR3.4蛋白表达水平均显著降低。PYR-41可显著改善AngⅡ所引发的小鼠左室肥厚，对AngⅡ引发左室组织SERCA2及KIR3.4蛋白的表达水平降低也有一定改善作用，但无显著性差异;PR-957改善AngⅡ所引发的小鼠左室肥厚及离子通道改变不如PYR-41显著。提示泛素-蛋白酶体抑制剂对心血管疾病及离子通道的影响还有待进一步实验研究。
　　第二部分 中国汉族人群中CAV1基因rs3807989多态性与房颤的相关性研究
　　背景:心房颤动（房颤，AF）是临床最常见的心律失常之一。据统计房颤在普通人群中的发病率约为1-2％，其发病率随着年龄的增长而增加，80岁以上人群中房颤的发病率高达10％。房颤是缺血性卒中最重要的危险因素，严重影响患者的生活质量和寿命。高血压、先天性心脏病、冠心病和瓣膜性心脏病等都是与房颤密切相关的心血管危险因素。房颤患者中近30％无确切危险及诱发因素，也称为孤立性房颤。许多证据显示基因因素与房颤（尤其是孤立性房颤）发病密切相关。过去短短10年里学者们通过全基因组关联分析(GWAS)已经证实和房颤发病有密切关系的基因有KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE2、KCNJ2、NUP155、NPPA、SCN3B、4q25、ZFHX3和KCNN3基因。CAV1基因(caveolin-1 gene)主要编码质膜小窝蛋白，几乎存在于所有细胞类型中，但在上皮细胞、脂肪细胞及内皮细胞等小窝丰富的细胞中有较高表达。CAV1参与细胞的各种功能，如囊泡运输、信号转导等。学者发现CAV1在心房肌中也有表达，目前有两个独立样本均证实CAV1与房颤相关。Olesen MS等研究证实在加拿大人群中CAV1基因rs3807989多态性与40岁以下人群孤立性房颤的发生密切相关，但此相关性尚需要在其他种族人群中行进一步验证。
　　目的:在中国汉族人群中验证CAV1基因rs3807989多态性与房颤的相关性。
　　方法:本研究采用病例对照研究，研究对象都是汉族人，为来自大连、武汉、随州、襄樊和十堰等城市多家医院的患者。纳入本研究的房颤患者共计839例，对照组1215例。由心内专家小组诊断房颤。入选的房颤患者年龄均为80岁以下。孤立性房颤是指那些无高血压、冠心病（CAD）、先天性心脏病、充血性心力衰竭、缺血性卒中及糖尿病的房颤患者。采集各研究对象的血液样本，利用Promega公司基因组DNA纯化试剂盒来提取基因组DNA;25ul反应体系来扩增DNA片段，成分如下:LC Green染料1μl，正向引物5pmol，反向引物5pmol，基因组DNA25ng，10×PCR缓冲液2.5ul(MgC121.5 mmol/L)，dNTPs5mmol，Taq聚合酶1U，其余以超纯水补足25ul体系。DNA扩增完毕后立刻应用Rotor-GeneTM6000高分辨率熔解系统（HRM，德国）进行rs3807989 SNP分型。在进行每次PCR反应和SNP分型时均将已经基因测序的三种基因型(A/A、A/G、G/G) DNA样本作为阳性对照、超纯水为阴性对照以确保实验结果的准确性。x2检验计算优势比(OR)及95％可信区间(95％ CI)。多因素Logistic回归分析校正性别、年龄、高血压、冠心病后计算3种遗传模式下校正p值(p-adj)、OR值以及95％CI。
　　结果:中国汉族人群中SNP rs3807989与房颤无显著性相关。多因素回归分析校正多变量后，等位基因形式下P-adj=0.828，OR=1.02;显性模式、加性模式及隐性模式下P-adj分别为0.815、0.405、0.760。进一步把房颤患者分为孤立性房颤(31.5％)和其他类型房颤(68.5％)，数据显示SNP rs3807989与孤立性房颤(p-adj=0.929，OR=0.990)或其他类型房颤（p-adj=0.597，OR=1.060）均无显著性相关。
　　结论:rs3807989基因多态性与孤立性房颤或其他类型房颤均无显著性相关。对中国汉族人群而言，CAV1基因rs3807989多态性可能不是房颤发病的危险因素。

目录

声明

摘要

第一部分 泛素-蛋白酶体抑制剂对左室肥厚及离子通道的影响

前言

实验材料与实验方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 中国汉族人群中CAV1基因rs3807989多态性与房颤的相关性研究

前言

实验材料与实验方法

一、研究对象

二、实验材料

三、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 离子通道与心律失常

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢