DC-SIGN和DC-SIGNR作为一种新的标记物在人类结肠癌患者中的表达及其临床意义

摘要

背景:结直肠癌是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，近20年来结肠癌的发病率及死亡率在世界上大多数国家都呈上升趋势，大多数的结肠癌患者发现已是晚期，预后较差。目前对于结肠癌的筛查和诊断的方法都是侵袭性的，结肠镜仍是其筛查诊断的金标准。近年来，粪便潜血试验是结直肠癌筛查中使用最普遍的非侵入性检查方法，但是，其灵敏度和特异度较低。如果简单的血清检测能够应用于它的早期诊断将有助于结肠癌的预防和预后，当前临床应用广泛的结肠肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)大大提高了结肠癌的诊断，降低死亡率和复发率，但它们的灵敏度和特异性不高。因此，它们作为结肠癌早期诊断的标志物的作用是很有限的。
　　在肿瘤的发生发展的过程中，细胞癌变、浸润和转移都可能与细胞膜上糖蛋白和糖脂发生改变有关。凝集素是具有对糖分子专一识别和结合功能的糖蛋白或蛋白质，在肿瘤研究中越来越受到重视，成为研究肿瘤发展及治疗中不可缺少的分子。本实验室已经报道，LSECtin(liver and lymph node sinusoidal endothelial cellC-type lectin)在大肠癌肝转移中起着重要的作用，并可能成为干预转移形成的很有前途的新目标。最近的研究表明，与前者同一家族的树突细胞特异性细胞间粘附分子3结合的非整合素(Dendritic cell-specific intracellular adhesionmolecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN，CD209)，作为一种凝集素，能与结肠癌细胞表面的癌胚抗原结合，参与了肿瘤的发生与发展。
　　最初由Geijtenbeek T B等研究DC细胞在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染过程中的作用时，发现了DC-SIGN，其是DC膜表面的一种C型凝集素，可以和T细胞表面的细胞间黏附分子3(ICAM-3)相互作用，介导DC细胞与T细胞的原始黏附，后来研究发现DC-SIGN可在DC黏附迁移及炎症反应、激活初始T细胞并启动免疫应答以及病原体与肿瘤的免疫逃逸等诸多方面发挥着重要作用。
　　DC-SIGN与其同系物DC-SIGNR(DC-SIGN-related protein，also known asL-SIGN，CD209L)，连同LSECtin和CD23作为一个C型凝集素的基因簇位于人类染色体19p13.3，DC-SIGN主要表达在于未成熟的DC和淋巴结内成熟DC细胞膜上，而DC-SIGNR主要表达在肝脏、淋巴结等内皮细胞表面。两者作为一种Ⅱ型跨膜蛋白质，在胞浆外区含有C型凝集素特有的糖识别结构域CRD（carbohydraterecognition domain），在Ca2+存在的条件下特异性的识别和结合许多病原体上的甘露糖和（或）岩藻糖的糖链，也可以和非唾液酸化的lewis糖结合。众所周知，结肠癌细胞而不是正常结肠上皮细胞表面的CEA有高度的岩藻糖基化（lewis糖），且有报道显示，在结肠癌中表达DC-SIGN的未成熟树突状细胞主要分布在肿瘤内部位，能够区分异常肿瘤细胞表面CEA并与其上的lewis糖结合。虽然DC-SIGNR与DC-SIGN有77％的氨基酸序列相同，但目前还没有关于DC-SIGNR与结肠癌关系的报道。
　　目的:1、检测结肠癌患者血清中可溶性DC-SIGN(the suloble DC-SIGN，sDC-SIGN)和可溶性DC-SIGNR(the suloble DC-SIGNR，sDC-SIGNR)的表达水平，分析其与健康对照组的区别;2、比较结肠癌患者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR表达水平根据TNM分期和转移情况分组时的区别，分析两者在疾病变化时的意义;3、比较早期结肠癌患者与健康对照组血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的水平，分析其在结肠癌早期诊断中的价值;4、与便潜血试验进行比较，分析血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的水平在结肠癌筛查中的意义;5、分析结肠癌患者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的水平与患者生存期的关系，评价其对结肠癌预后的影响;6、监测结肠癌患者在病情发展过程中的变化情况，分析其在个体化病情判断中的作用;7检测结肠癌患者组织中DC-SIGN和DC-SIGNR的表达情况，分析各组的差别;8、检测死亡患者组织中的DC-SIGN中的表达情况与患者生存期的关系，分析其在结肠癌预后中的价值。
　　方法:1、应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对182例结肠癌患者和101位健康志愿者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的水平进行检测;2、应用电化学发光的方法检测血清中CEA、CA199的表达水平;3、应用免疫胶体金的方法检测结肠癌患者粪便中的潜血情况;4、应用免疫组织化学的方法评估DC-SIGN和DC-SIGNR在结肠癌组织中的表达，并应用Image Pro Plu图像分析系统对DC-SIGN的免疫组织组化结果进行了半定量分析。
　　结果:1、结肠癌患者血清中有sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达，且结肠癌患者sDC-SIGN水平明显低于健康对照组，sDC-SIGNR的水平却明显高于健康对照组;2、不同TNM分期的结肠癌患者Ⅲ期患者血清中的sDC-SIGN水平最低（淋巴结转移的患者表达水平低）;然而，血清sDC-SIGNR的水平随分期的增加而升高;3、血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达水平与性别、年龄、肿瘤细胞分化程度以及血清肿瘤标记物CEA、CA199等指标无明显相关性;4、对于结肠癌的诊断，两者的最佳浓度分别为sDC-SIGN＜2.226μg/ml、 sDC-SIGNR＞227.2ng/ml，前者具有高敏感性，后者具有高特异性，两者联合诊断时敏感性和特异性都大于95％;5、早期（Ⅰ/Ⅱ期）结肠癌患者组sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达水平与健康对照组比较有明显差异，P＜0.05，在结肠癌的早期诊断中两者优于CEA、CA199;6、血清sDC-SIGN＞2.226μg/ml时对结肠癌进行筛查真阳性率96.6％，比便潜血检测(58.6％)高，且假阴性率低;7、血清sDC-SIGN＞2.226μg/ml的结肠癌患者与sDC-SIGN＜2.226μg/ml的患者相比生存期较长;8、11例结肠癌患者的连续监测结果显示血清sDC-SIGN水平受治疗影响较小，而在发生转移时变化较大;9、DC-SIGNR在正常结肠组织和癌巢中表达阴性，只在癌巢中间表达呈弱阳性;10、DC-SIGN正常结肠组织是微弱表达，在结肠癌组织呈强表达;DC-SIGN在组织中的表达水平与血清sDC-SIGN水平呈负相关，r=-0.4643，而与血清中CEA的水平无相关性;11、死亡患者的结肠癌组织中DC-SIGN表达的平均密度＞0.001219（正常结肠组织表达的95％可信区间）的患者的生存时间明显高于其他患者。
　　结论:1、首次在血清中检测到sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达，且随肿瘤的分期或转移情况不同而呈不同的表达水平;2、sDC-SIGN和sDC-SIGNR可作为结肠癌的早期诊断的生物标记物，sDC-SIGN具有高敏感性，而sDC-SIGNR具有高特异性，两者联合诊断具有较高的诊断价值;3、血清sDC-SIGN水平作为结肠癌高危人群筛查指标优于便潜血试验;4、结肠癌患者血清sDC-SIGN水平高表达者与低表达者相比有较长的生存期，可以为医生评估患者的预后提供帮助;5、DC-SIGNR在结肠癌组织中不表达，DC-SIGN在结肠癌组织中的表达随病情进展而升高，且其的表达水平影响患者的生存时间，与疾病的预后相关;6、DC-SIGN和DC-SIGNR虽然为同系物，但他们在结肠癌的发生、发展及预后中的作用却不相同。
　　总之，DC-SIGN和DC-SIGNR，尤其是DC-SIGN，可以作为结肠癌的早期诊断、病情变化和预后评估的新的分子标记物。

目录

声明

摘要

第一部分：DC-SIGN和DC-SIGNR在结肠癌患者血清中表达

前言

材料和方法

1．材料

2．方法

结果

1．标准曲线的拟合

2．结肠患者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达水平

3．结肠患者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达水平与性别年龄的相关性

4．结肠患者血清中sDC-SIGN和sDC-SIGNR的表达水平与血清中CEA、CA199和肿瘤细胞的分化程度没有相关性

5．sDC-SIGN和sDC-SIGNR在结肠癌患者中不同TNM分期及转移情况差异分析

讨论

结论

参考文献

第二部分：DC-SIGN和DC-SIGNR在结肠癌诊断及预后中的临床意义

前言

材料和方法

1．材料

2．方法

结果

1．sDC-SIGN和sDC-SIGNR在结肠癌诊断中的价值

2．sDC-SIGN和sDC-SIGNR在结肠癌早期诊断中的应用价值

3．sDC-SIGN和sDC-SIGNR与便潜血试验相关性分析

4．血清sDC-SIGN和sDC-SIGNR水平与结肠癌患者生存期的相关性

5．11例结肠癌患者血清sDC-SIGN水平变化连续监测结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：DC-SIGN和DC-SIGNR在结肠癌组织中的表达

前言

材料和方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．应用免疫组化的方法检测结肠癌组织及癌旁正常组中DC-SIGN和DC-SIGNR的表达

2．结肠癌组织中DC-SIGN表达的半定量分析及与同一个患者血清中sDC-SIGN和CEA的相关性分析

3．DC-SIGN的表达水平与结肠癌患者不同TNM分期的差异

4．DC-SIGN的表达水平与患者生存率的相关性

讨论

结论

参考文献

附表

综述 DC-SIGN的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢