Wnt/β-catenin信号途径和核心岩藻糖基化的交互作用在HEK293T细胞中的作用机制研究

摘要

岩藻糖基转移酶8(Fucosyltransferases8，FUT8)又称为核心岩藻糖基转移酶，识别N-糖链与天冬酰胺相连的核心GlcNAc，将岩藻糖基从供体GDP-Fucose转移至此位置，形成α1，6糖苷键。岩藻糖基转移酶家族共有13个成员，而FUT8地位特殊，它识别位点单一，且没有功能冗余，对其进行研究具有重要意义。FUT8通过对靶蛋白的N-糖链进行修饰而影响其结构和功能，从而参与细胞内信号通路、细胞增殖、侵袭转移、细胞间粘附、免疫应答等过程。已有研究表明，FUT8在神经突触形成、老化等生理过程发挥重要作用;在肝癌、结肠癌、肺癌、慢阻肺、卵巢癌、肾纤维化、胃癌、胰腺癌、神经分裂等多种疾病中出现表达和活性异常，其靶蛋白AFP已经作为分子标志物，应用于肝癌临床诊断。
　　Wnt信号通路在细胞增殖、分化、维持成体干细胞自我更新等生理过程发挥着重要作用，同时在肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、毛囊癌等多种疾病中表出现过度激活。在目前已知的三条Wnt信号通路传导途径中，经典Wnt/β-catenin信号途径的研究最为透彻，本文在此基础上作进行研究。
　　在肝癌、肺癌、结肠癌等多种疾病中，大量病例同时出现Wnt/β-catenin信号途径过度激活和FUT8表达异常，而此二者之间是否存在协同关系尚未明确。本实验利用HEK293T细胞，其Wnt信号通路处于正常状态，FUT8表达及活性处于正常水平;通过过表达相关蛋白，观察该信号通路和FUT8及核心岩藻糖基化的交互作用，并对其分子机制进行初步探索。
　　实验方法:
　　1)在HEK293T细胞中，通过过表达β-catenin、Wnt3a蛋白来激活Wnt信号通路，利用Western-blot和HPLC检测细胞内FUT8蛋白表达水平和催化活性;
　　2)通过转染FUT8过表达质粒及其空载体，利用Western-blot、荧光素酶报告基因、细胞免疫荧光化学等实验，观察FUT8对Wnt/β-catenin信号途径的激活作用;利用平板克隆形成实验观察FUT8对细胞增殖能力的影响;
　　3)利用蛋白合成抑制剂Cycloheximide和蛋白酶体抑制剂MG132，观察FUT8对β-catenin蛋白稳定性和细胞内整体泛素化水平的影响;利用免疫共沉淀、Lectin-blot、Western-blot等实验观察核心岩藻糖基化修饰对β-catenin蛋白的影响。
　　实验结果:
　　1)Western-blot和HPLC结果显示，在HEK293T细胞中，Wnt/β-catenin信号途径激活时，FUT8蛋白表达水平增高，催化活性增强;
　　2)Western-blot结果显示，过表达外源性FUT8后，HEK293T细胞内Wnt/β-catenin信号途径主要分子β-catenin、Wnt3a、Dvl2蛋白含量增加，该通路靶基因表达上调;细胞免疫荧光化学、荧光素酶报告基因结果显示，过表达外源性FUT8促使β-catenin蛋白定位于细胞核，激活信号通路;同时，平板克隆形成实验结果显示，过表达FUT8可以增强HEK293T细胞活力，促进细胞增殖;
　　3)Western-blot结果显示，过表达FUT8能够提高HEK293T细胞内β-catenin蛋白稳定性，降低细胞内蛋白泛素化修饰水平;免疫共沉淀及Lectin-blot结果显示，β-catenin或该通路其他分子可能作为FUT8靶蛋白发生核心岩藻糖基化修饰。
　　实验结论:
　　在HEK293T细胞中，激活Wnt/β-catenin信号途径可以上调FUT8蛋白表达水平和催化活性。过表达核心岩藻糖基转移酶FUT8可以激活Wnt/β-catenin信号途径，同时促进细胞增殖。上述现象可能的分子机制是FUT8过表达后导致Wnt/β-catenin信号途径中β-catenin或其他重要分子发生核心岩藻糖基化修饰，阻碍β-catenin发生磷酸化和泛素化修饰，抑制β-catenin经由蛋白酶体途径降解，导致其在细胞内累积，并由此激活Wnt/β-catenin信号途径。

目录

声明

摘要

(一)前言

第一部分 Wnt／β-catenin信号途径的激活促进HEK293T细胞内FUT8的表达和催化活性

(二)材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

(四)小结

第二部分 在HEK293T细胞中过表达FUT8导致Wnt／β-catenin信号途径激活

(二)材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

(四)小结

第三部分 FUT8对Wnt／β-catenin信号途径激活作用机制研究

(二)材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

(四)小结

三．讨论

四．结论

五．综述 核心岩藻糖基转移酶(FUT8)研究进展概述

参考文献

致谢