LOX在前列腺癌中的表达及其干预前列腺癌细胞凋亡及侵袭的实验研究

摘要

前列腺癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤,其发病率在东西方各国呈逐渐升高趋势。肿瘤细胞最重要的恶性生物学行为是侵袭与转移,而前列腺癌最常见的转移部位是骨骼系统。肿瘤的转移需要经历“粘附-侵袭-转移”等诸多步骤,在此过程中,肿瘤细胞与细胞外基质粘附,细胞通过细胞外基质侵袭,进而在靶器官形成肿瘤转移灶。细胞外基质在LOX等诸多蛋白酶的作用下发生重构,肿瘤细胞在转移后通过配体-受体结合机制形成新的转移灶。而在前列腺癌中,LOX参与细胞外基质的重构及肿瘤细胞形成转移及转移灶的具体机制尚不明了。
　　细胞外基质中含量最丰富的结构是胶原蛋白家族,尤其是CollagenⅠ,是在细胞外基质中含量＞90％的支架蛋白,同时也是骨骼系统含量最丰富的结构。肿瘤细胞在转移过程中首先需要启动相关恶性表型,使肿瘤细胞粘附在细胞外基质上,同时分泌MMPs、LOX等蛋白酶,通过促使CollagenⅠ降解及交联,导致细胞外基质重构;最终通过细胞外基质的传递,到达新的转移灶。在此过程中,细胞膜表面的整合蛋白家族Integrin及钙粘蛋白家族成员介导肿瘤细胞与细胞外基质的粘附,而有研究表明,在LOX的介导下,CollagenⅠ发生交联,限制肿瘤细胞转移,而在MMPs家族的影响下,肿瘤细胞又可以通过CollagenⅠ交联后形成的隧道发生转移。纤维连接蛋白Fibronectin将相关信号传递至细胞膜表面的Integrin蛋白家族,再次影响肿瘤的恶性生物学行为。本实验通过对前列腺癌组织标本及肿瘤细胞系的实验研究,探讨LOX参与调节前列腺癌侵袭与转移的具体分子机制。
　　目的:
　　1.检测前列腺癌组织标本中LOX的表达情况,用以探讨前列腺癌中LOX变化及其与前列腺癌患者临床指标的关系;
　　2.探讨三维培养条件下LOX对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响;
　　3.分析LOX影响前列腺癌恶性生物学行为过程可能的具体分子机制及重要因子。
　　方法:
　　1.收集77例前列腺癌患者的临床资料,按照Gleason评分系统对癌组织进行病理分级,将前列腺癌组织分为两区:主要分级区和次要分级区,分别对每一区进行评分,每区分值按照肿瘤分化程度的高低分为1-5分,将分化良好的记为1分,分化极差的记为5分,通过相加两区的Gleason分值即可得到Gleason评分,评分结果显示:高、中分化癌的分值为2-7分（32例）,低分化癌的分值为8-10分(45例);按照TNM分期示低分级前列腺癌(T1-2)33例,高分级前列腺癌(T3-4)44例;非转移前列腺癌50例,转移前列腺癌27例。
　　2.我们首先对前列腺癌组织标本进行免疫组织化学实验,根据Gleason评分、肿瘤是否转移、临床分期等分组。根据免疫组化染色阳性细胞的数量及切片的染色程度来进行免疫组化评分。
　　3.应用CollagenⅠ进行前列腺癌细胞系三维培养,采用LOX特异性抑制剂BAPN处理细胞,后采用细胞粘附、Transwell、TUNEL实验等检测CollagenⅠ中前列腺癌细胞的恶性表型。
　　结果:
　　1.LOX在前列腺组织标本中的表达及临床意义
　　通过免疫组织化学方法检测,结果显示LOX在前列腺增生及前列腺癌细胞核,细胞质,细胞外基质中均有表达,同时,在Pca细胞外基质中,LOX的表达强度明显低于BPH组(P＜0.05)。相反,随着前列腺癌肿瘤级别和分期的增高,LOX的表达明显降低(P＜0.05),而其表达与是否有转移(p=0.272)及PSA值(p=0.54)无显著关联。与此同时,我们检测了BPH及Pca组织中CollagenⅠ的表达,结果表明,BPH中CollagenⅠ的表达明显高于Pca(P＜0.05),并且,随着肿瘤Gleason分级的增高及转移的发生,其表达进一步下降(P＜0.05);通过Spearman's检验分析得出的结果是,细胞外基质中CollagenⅠ与LOX具有密切的相关性(r=0.722,P＜0.01)。接下来,我们应用Kaplan-Meier生存曲线分析细胞外基质中LOX的表达与前列腺癌患者总生存率的关系。结果表明,细胞外基质中LOX表达低的患者平均生存时间为27.89个月,细胞外基质中LOX表达高的患者平均生存时间为40.61个月,说明LOX可能成为前列腺癌预后不良的风险因素。
　　2.LOX影响前列腺癌PC-3细胞粘附、凋亡及侵袭的实验研究
　　采用CollagenⅠ对前列腺癌PC-3及LNCaP细胞系进行三维细胞培养,细胞粘附实验表明,来源于骨转移灶的PC-3细胞在CollagenⅠ上的粘附能力高于来源于淋巴结转移灶的LNCaP细胞;侵袭实验表明,LOX被抑制后, PC-3细胞侵袭能力明显增高(P＜0.05);TUNEL实验表明,LOX被抑制后,PC-3细胞的凋亡敏感性明显降低(P＜0.05)。
　　3.LOX是影响前列腺癌恶性表型传导通路的重要因子
　　通过MTT实验表明,预先采用不同浓度(0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml)的BAPN处理PC-3细胞,随着BAPN浓度的逐渐增高,其12h、24h、48h相对应的平均细胞生长抑制率逐渐降低。随后,应用Real-time PCR检测±BAPN条件下48小时后PC-3细胞中MMP-2、Integrinα5、Fibronectin mRNA的表达,结果表明,LOX被抑制后,MMP-2(P＜0.05)、Integrinα5(P＜0.05)、FN(P＜0.05)mRNA表达明显增高。
　　结论:
　　1.LOX在前列腺癌及前列腺增生组织中均有表达;并且,随着肿瘤级别及临床分期的增高,其表达逐渐下降;LOX高表达的前列腺癌患者平均生存期更长;
　　2.在CollagenⅠ模拟细胞外基质三维培养下,特异性抑制LOX能够增加肿瘤的侵袭并降低PC-3细胞的凋亡敏感性;同时骨转移灶来源的PC-3细胞在CollagenⅠ的粘附能力明显高于LNCaP细胞;
　　3.采用BAPN特异性抑制LOX活性后,MMP-2、Integrinα5、Fibronectin等分子表达增高,提示LOX与MMP-2、Integrinα5、Fibronectin呈负相关,这些因子共同参与调节前列腺癌细胞的恶性生物学行为。

目录

声明

摘要

第一部分 LOX(赖氨酰氧化酶)在前列腺增生及前列腺癌组织中的表达及其临床意义

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 LOX影响前列腺癌细胞PC-3细胞表型及侵袭能力的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 LOX参与调节前列腺癌细胞恶性生物学行为作用机制的研究

前言

1、材料和方法

2．结果

讨论

结论

参考文献

总结

文献综述 赖氨酰氧化酶家族对恶性肿瘤生物学行为影响的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢