白藜芦醇对宫颈癌侵袭转移因子MMPs/TIMPs、S100A4、CD44的表达调节及其生物学意义

摘要

宫颈癌是世界范围内第三种常见的恶性肿瘤，是导致女性死亡的重要原因之一。人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的最主要危险因素，尤其是高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌变的重要原因之一。宫颈癌的病理类型以鳞癌和腺癌最为常见。宫颈癌的预后与临床分期、病理类型等因素密切相关:中晚期宫颈癌因有远处转移而预后极差;宫颈腺癌因转移较早，预后相对较差。通常对宫颈癌术后及晚期宫颈患者采用放化疗联合的治疗方案，以控制盆腔复发、减少转移、延长患者的生存期;但由于肿瘤患者对放化疗的敏感性降低、耐药性增强，放化疗药物的毒副作用等原因使其治疗效果并不理想。因此探究宫颈侵袭转移的分子机制，并寻求一种毒副作用较小的适合不同病理类型宫颈癌的特异性治疗方法，对于宫颈癌患者的个体化治疗有着极其重要的临床应用价值。
　　肿瘤的侵袭转移是一系列复杂的多步骤过程，现已知广泛的蛋白水解作用与基底膜的重塑是恶性肿瘤转移潜能的重要标志。侵袭过程中多种基质金属蛋白酶(MMPs)参与了对细胞外基质(ECM)成分的降解。其中可降解Ⅳ型胶原和明胶的MMP-2和MMP-9在多种转移癌中呈现高表达，并与患者的不良预后密切相关。MMPs的活性可受到基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的控制作用。如TIMP-2可特异性抑制MMP-2，而TIMP-1优先与MMP-9结合。TIMPs与MMPs间内稳态平衡的破坏是恶性肿瘤进展的首要步骤，也是肿瘤进展中极为重要的早期分子事件。
　　S100A4属于S100超家族成员。人S100A4基因的前两个外显子不含编码序列与转录调控有关，其常见的拼接异构体有AS1、AS2两种。S100A4可参与细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成等多种病理生理过程。研究发现在多种肿瘤组织中S100A4呈现过表达。S100A4在肿瘤进展与转移中起着重要作用，被视为转移相关基因。临床资料亦显示S100A4表达与癌症患者的预后密切关联。故S100A4可作为评价肿瘤转移潜能、预测患者预后的独立生物学指标。
　　CD44是位于细胞表面的跨膜糖蛋白，主要参与细胞间相互作用、细胞粘附和细胞迁移。由于可变剪接该基因可产生许多功能不同的亚型，如CD44s和CD44v。大量研究报道CD44表达的变化与多种癌症的转移潜能有关。其中CD44v6与肿瘤的关系最为密切，其过表达能使肿瘤细胞获得侵袭转移的能力。多项研究表明CD44及其变异体在多种癌症发生发展中的作用具有多面性，提示CD44对肿瘤的影响因肿瘤的不同进展阶段而异，与癌症的组织类型有关。
　　HPV感染是宫颈癌发生的最主要危险因素。高危型HPV(HPV16、HPV18)的持续性感染与宫颈的癌前病变和侵袭性宫颈癌的发生最为密切。高危型HPV的E6与E7病毒癌蛋白分别抑制宿主细胞的p53和RB蛋白，它们的失活可诱导细胞的恶性转化。此外最新研究表明，HPV16的E6/E7可以某种方式促进癌细胞的侵袭潜能，有助于宫颈癌的进展与播散。
　　白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄等植物组织中的多酚类化合物。研究发现白藜芦醇能够抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制侵袭转移，这使其成为抗肿瘤的天然武器。作为无毒副作用的新型药物白藜芦醇，具有抗宫颈癌的作用。尤其近年来发现白藜芦醇可抑制MMP-9的表达，降低了癌细胞的迁移与侵袭能力。综上所述，深入探究白藜芦醇对宫颈癌中侵袭转移相关因子的抑制作用及其潜在机制，对于宫颈癌晚期患者的个体化治疗，提高患者生存的质量有着重要的临床意义。
　　目的:
　　在多种肿瘤中已证实MMP-2/-9、S100A4、CD44s/v6及HPV16的促癌作用，但关于它们在两种类型宫颈癌中的表达特点、分布模式以及与侵袭转移相互关系的综合研究鲜有报道。为深入阐明宫颈癌侵袭转移的复杂分子机制，揭示相关因子在宫颈癌中的具体作用。本研究着重探讨MMP-2/-9、S100A4、CD44s/v6、HPV感染在宫颈癌中的表达规律、相互作用的潜在机制以及在侵袭转移中扮演的角色;并探究白藜芦醇处理宫颈癌细胞前后MMP-2/-9、S100A4、CD44s/v6的表达变化，揭示其抗侵袭转移的机制所在，为晚期宫颈癌治疗寻求一种无毒有效的治疗方法。
　　方法:
　　人宫颈癌及正常宫颈组织的石蜡组织标本由中国医科大学附属盛京医院提供。人宫颈腺癌细胞HeLa及鳞癌细胞SiHa、C33a购自上海中科院细胞库。本研究基于石蜡组织微阵列技术，利用免疫组织化学染色检测MMPs/TIMPs、S100A4、CD44、HPV在宫颈癌中的表达状态;通过免疫细胞化学、RT-PCR、 Western-blot蛋白印迹等方法，检测白藜芦醇处理前后三种宫颈癌细胞中MMPs/TIMPs、S100A4、CD44表达的改变，分析探讨白藜芦醇对侵袭转移相关因子抑制的潜在分子靶点。实验数据采用SPSS12.0软件，应用Kruskal-Wallis、Mamm Whitney检验法，对各指标进行统计学分析，应用Spearmen相关性检验各指标表达的相互关系。
　　结果:
　　一、MMPs/TIMPs在宫颈癌中的表达特点及相关性分析
　　1、MMP-9与TIMP-1
　　与正常宫颈相比宫颈腺癌与鳞癌中TIMP-1、MMP-9的表达均明显增加(P＜0.05)。腺癌与鳞癌相比TIMP-1的表达无差异，即TIMP-1在宫颈癌中的表达水平与组织病理类型无关。MMP-9在鳞癌中的表达水平高于腺癌(P=0.04)。TIMP-1与MMP-9的表达呈正相关(r=0.56，P=0.00)即MMP-9表达增加的同时TIMP-1的表达也在增加，且从正常上皮到癌组织，MMP-9表达增加的幅度要高于TIMP-1。
　　2、MMP-2与TIMP-2
　　宫颈腺癌与鳞癌与对应的正常宫颈组织相比，TIMP-2、MMP-2的表达均显著增加(P＜0.05)。TIMP-2在鳞癌中表达水平高于腺癌(p=0.05)。MMP-2在腺癌与鳞癌中的表达无差异(P=0.96)，即MMP-2在宫颈癌中的表达与组织病理类型无关。TIMP-2与MMP-2的表达呈正相关(r=0.51，P=0.00)即TIMP-2与MMP-2的表达协同增加，并且在肿瘤进展中MMP-2增加的幅度要高于TIMP-2。
　　3、MMP-2与MMP-9与低、中、高三种分化程度宫颈癌的相关性分析
　　MMP-2、MMP-9均与鳞癌的分化程度无相关性，P＞0.05。MMP-2与腺癌的分化程度呈负相关(P=0.046，r=-0.51)，即分化程度（恶性程度）越低，MMP-2的表达越高。而MMP-9与腺癌的分化程度却无相关性。
　　二、S100A4在宫颈癌中的表达特点及与MMP-2、MMP-9之间的相关性
　　与正常宫颈相比，宫颈鳞癌与腺癌中S100A4的表达均明显增加(P＜0.05)。S100A4在腺癌与鳞癌中的表达无差异，即S100A4的表达与宫颈癌组织病理类型无关(P=0.36)。S100A4的表达程度与宫颈癌的分化程度无关(P＞0.05)。S100A4与MMP-2、MMP-9的表达均呈现显著正相关(P=0.00，r＞0)，即宫颈癌中S100A4与MMP-2、MMP-9的表达协同增加。
　　三、CD44s、CDv6在宫颈癌中的表达特点、与宫颈癌分化程度的相关性分析
　　宫颈腺癌、鳞癌中CD44v6的表达显著上升(P＜0.05)。鳞癌较鳞状上皮中CD44s的表达明显下降(P=0.03)。腺癌和腺上皮相比CD44s的表达无差异(P=0.32)。CD44v6、CD44s在宫颈癌中的表达均与组织病理类型无关(P=0.08，P=0.23)。腺癌中CD44v6、CD44s的表达与分化程度呈负相关(P＜0.01;r＜0)，即CD44v6、CD44s的表达与腺癌的恶性程度有关。宫颈鳞癌的分化程度越低，CD44v6的表达量也越高(P=0.00，r=-0.56);而CD44s的表达却与鳞癌的分化程度无关(P=0.45)。四、不同病理类型的宫颈组织中HPV的感染情况及与MMP-2/-9、S100A4、CD44v6表达的相关性分析
　　与正常宫颈相比，两种类型宫颈癌中HPV16、HPV广谱感染阳性率明显增高，HPV16感染与宫颈鳞癌的关系更为密切。HPV16感染宫颈癌中68.8％的女性小于45岁，暗示性活跃程度是宫颈癌的危险因素。HPV16感染只与MMP-9的表达呈显著正相关(P=0.00，r=0.43)，然而与MMP-2、S100A4、CD44v6的表达均无关，这提示HPV16与MMP-9协同作用参与了侵袭转移的复杂过程。
　　五、白藜芦醇处理宫颈癌细胞前后MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2、S100A4、CD44v6/CD44s的表达变化
　　经100μM白藜芦醇处理48小时后，宫颈癌细胞(HeLa、SiHa、C33a)的生长明显受到抑制，细胞数量明显变少，形态有同程度的改变;MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2、S100A4的表达水平明显降低，具有均协同性。白藜芦醇虽可下调CD44v6在HeLa和SiHa细胞中的表达，却可上调C33a中CDv6的表达。然而处理前后宫颈癌细胞中CD44s的表达变化不明显。
　　六、S100A4的拼接异构体在不同类型宫颈组织及胃癌细胞中的表达情况
　　三种宫颈癌细胞和两种胃癌细胞(MGC803、BGC823)均有AS1、AS2的转录物，但AS2的表达明显强于AS1。正常宫颈组织也都有AS1、AS2，但AS2的表达强度却明显弱于AS1。宫颈癌细胞经白藜芦醇处理后AS1和AS2的表达均下降，并以AS2下降更为显著。
　　结论:
　　一、MMP-9/TIMP-1与MMP-2/TIMP-2在宫颈癌中均呈现高表达，具有协同性。MMPs/TIMPs的动态变化是宫颈癌侵袭转移过程中的重要分子事件。MMP-9和TIMP-2的表达与宫颈癌的组织病理类型相关。MMP-2可作为判定宫颈腺癌恶性程度的参照指标。
　　二、S100A4在宫颈癌组织中的表达显著增高，可作为判定宫颈癌恶性生物学行为的参考指标。S100A4与MMP-2、MMP-9的协同表达，共同参与了宫颈癌的侵袭与转移过程。
　　三、CD44v6在宫颈癌中的表达显著上升并与肿瘤分化程度呈负相关，CD44v6在某种程度上反映了宫颈癌的恶性程度及不良预后。CD44s在鳞癌中的表达降低，并与腺癌的分化程度相关，CD44s不能作为宫颈癌一个稳定的评价指标。
　　四、HPV感染（尤其是高危型HPV16感染）是导致宫颈癌发生的重要原因，HPV16感染与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。HPV16感染只与MMP-9的表达呈显著正相关，揭示HPV16感染可能以某种方式（与MMP-9密切相关）参与了宫颈癌的侵袭转移过程。
　　五、白藜芦醇可明显抑制三种宫颈癌细胞(HeLa、SiHa、C33a)的生长，并抑制侵袭转移相关因子MMP-2、MMP-9、S100A4、CD44v6的表达，提示白藜芦醇具有抗肿瘤侵袭转移这一潜在分子机制，对于治疗人类侵袭性宫颈腺癌和鳞癌具有潜在的临床应用价值。
　　六、S100A4异构体AS1、AS2虽然在宫颈癌细胞与正常宫颈组织中均有表达，但宫颈癌细胞中异构体AS2的表达明显高于正常宫颈组织，提示AS2并非AS1更能代表宫颈癌的恶性生物学行为，具有一定的肿瘤学价值。
　　总之，在宫颈癌的发生发展过程中，多种侵袭转移相关因子如MMP-2/-9、S100A4、CD44v6及HPV16可能通过不同的途径或协同作用共同参与了这一过程。对于侵袭性宫颈癌临床治疗这一难题，无毒副作用的白藜芦醇抗侵袭转移的药理作用使其有望成为治疗侵袭性宫颈癌的候选药物之一。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一部分 MMP-9／TIMP-1、MMP-2／TIMP-2、S100A4和CD44s／v6在不同类型宫颈癌中的表达特点

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 HPV16和HPV广谱在不同类型宫颈癌组织的表达特点及与MMP-2／-9、S100A4和CD44v6的相关性

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 白藜芦醇对宫颈癌细胞侵袭转移相关因子MMPs／TIMPs、S100A4、CD44s／v6表达的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 MMPs与其抑制剂TIMPs在恶性肿瘤发生发展中的作用

附录

致谢