Ras诱导的线粒体功能障碍在肝癌发生发展中的作用机制研究

摘要

目的:
　　探讨癌基因Ras诱导的线粒体功能障碍在肝癌发生发展中的分子作用机制。
　　方法:
　　1.采集正常对照雄性小鼠的正常肝组织样本和H-ras12V转基因雄性小鼠的肝癌组织及癌旁组织样本,分别进行病理分析和总蛋白质和总RNA及线粒体的提取;采用比色法定量检测试剂盒检测组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性;转录组测序和RT-qPCR法检测组织中线粒体复合物关键酶及Bcl-2和Ucp2的mRNA表达水平;免疫荧光测定试剂盒检测组织中的ROS水平。
　　2.应用ERK抑制剂司美替尼抑制转基因雄性小鼠后检测抑制ERK对线粒体功能的影响。
　　结果:
　　1.比色法定量检测结果表明,与正常雄性小鼠肝组织相比,转基因雄性小鼠癌旁组织和肝癌组织的复合物Ⅰ活性均显著降低,F=14.26,P=0.003。呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ/Ⅳ关键酶的mRNA表达水平检测结果表明,与正常肝组织相比,肝癌组织和癌旁组织的Ndufa12、Nduf s6、Uqcrb、Cox7a2表达水平均显著降低,统计量分别为F=18.55,P=0.001;F=7.06,P=0.014;F=12.81,P=0.002;F=10.51,P=0.004。免疫荧光检测表明,与正常肝组织和肝癌组织相比,癌旁组织中的ROS水平显著升高,F=31.35,P=0.001。与正常肝组织和癌旁组织相比,肝癌组织中的Bcl-2和Ucp2表达水平均显著升高,统计量分别为F=20.29,P=0.002;F=15.51,P=0.001。
　　2.抑制实验结果显示:应用司美替尼抑制剂后,蛋白质免疫印迹检测抑制效果,结果显示,在转基因雄性小鼠癌旁组织中,与对照组相比,司美替尼处理组中p-ERK表达水平显著降低,F=42.99,P=0.022;在转基因雄性小鼠肝癌组织中,与对照组相比,司美替尼处理组中p-ERK表达水平显著降低,F=43.34,P=0.002;表明抑制效果良好。线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ/Ⅳ关键酶的mRNA表达水平检测结果表明,在转基因雄性小鼠癌旁组织中,与对照组相比,司美替尼处理组的Ndufa12、Uqcrb、Cox7a2 mRNA表达水平显著上调,统计量分别为F=4.05,P=0.084;F=11.25,P=0.015;F=31.007,P=0.001。在转基因雄性小鼠肝癌组织中,与对照组相比,司美替尼处理组的Nduf12、Uqcrb、Cox7a2mRNA表达水平显著上调,统计量分别为F=5.81,P=0.042;F=5.79,P=0.043;F=15.17,P=0.008。
　　结论:
　　Ras癌基因的表达可能通过ERK信号通路下调肝组织线粒体呼吸链复合物关键酶的表达,进而导致线粒体功能障碍并提升细胞内ROS水平。肝癌细胞通过促进Bcl-2和Ucp2的表达降低线粒体产生的ROS,进而促进肝癌的发生发展。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 方法

3 统计学方法

结果

1．病理分析

2．线粒体复合物Ⅰ活性的检测

3．线粒体呼吸链复合物Ⅰ／Ⅲ／Ⅳ关键基因的转录组学检测

4．RT-qPCR检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ／Ⅲ／Ⅳ关键酶的mRNA表达水平

5．ROS水平的检测

6． RT-qPCR检测Bcl-2和Ucp2 mRNA的表达水平

7． ERK抑制剂对p-ERK表达水平的影响

8． RT-qPcR检测ERK抑制剂处理后线粒体呼吸链复合物Ⅰ／Ⅲ／Ⅳ关键酶的mRNA表达水平

讨论

结论

参考文献

综述 线粒体功能障碍与肿瘤

攻读学位期间发表论文情况

致谢