SPINK1慢病毒过表达载体和其稳转AsPC-1细胞株的构建及其对人胰腺癌细胞增殖的影响

摘要

目的:丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine protease inhibitor Kazal type1,SPINK1)是Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族中主要的成员之一,其在人体诸多的生理和病理过程中发挥着重要的作用。 SPINK1具有胰蛋白酶抑制因子、类似生长因子和自噬的负调节因子等多重生物学功能。在胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌等多种癌症组织中均可检测到SPINK1的表达,有研究发现SPINK1能促进前列腺癌和结直肠癌细胞的增殖,但其是否能促进某些类型肿瘤细胞(如胰腺癌细胞)的增殖尙存在争议,而且其中的作用机制至今仍不清楚。本课题的目的是设计并制作包含人SPINK1基因的完整编码区序列的慢病毒过表达载体,用此载体感染人胰腺癌AsPC-1细胞,并建立SPINK1过表达的稳转AsPC-1细胞株,以此来探索此基因在胰腺癌细胞中是否具有促进肿瘤细胞增殖和克隆形成的能力,并为今后进一步的研究奠定基础。
　　方法:首先构建SPINK1慢病毒过表达载体,包装病毒并产生病毒颗粒。应用PCR方法扩增SPINK1基因的全部编码序列,经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后切胶回收DNA,将其与慢病毒载体(pLenti-CMV-2A-GFP)同时用限制性内切酶酶切后,用T4 DNA连接酶进行连接,将构建好的人SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)进行转化,提取DNA进行酶切后,通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定。用已鉴定正确的SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞产生病毒颗粒,过滤并高速离心浓缩病毒颗粒。然后用此病毒颗粒感染并建立SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株,使用嘌呤霉素(2ug/ml)药物筛选病毒感染后的阳性克隆并扩增,培养成SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株。通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot的方法检测病毒感染后SPINK1基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达变化。最后用CCK-8法、台盼蓝染色法、流式细胞仪检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力的影响,并通过平板细胞克隆形成实验来检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞克隆形成能力的影响。
　　结果:经酶切、琼脂糖凝胶电泳实验和基因测序鉴定,证实SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)构建正确。 SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到许多绿色荧光点,并伴有漂浮细胞和破裂细胞,感染效率可达90％。用慢病毒颗粒感染AsPC-1细胞,经嘌呤霉素药物筛选出阳性克隆,将阳性克隆连续培养扩增数代后经Real-time PCR和Western Blot的方法检测, SPINK1基因可在AsPC-1细胞中稳定高效地表达,与阴性对照相比病毒感染后的SPINK1基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达量分别上调了25倍和5倍。在CCK-8实验中, SPINK1过表达AsPC-1细胞的光密度值为1.4OD,对照组细胞的光密度值为1.0OD,差异有统计学意义(P＜0.001);台盼蓝染色检测细胞活性的实验发现, SPINK1过表达AsPC-1细胞的活性为(93.30±0.40)％,对照组细胞活性为(71.97±0.78)％,差异有统计学意义(P＜0.001);流式细胞仪检测细胞周期的实验中, SPINK1过表达AsPC-1细胞处于DNA合成期(S期)和DNA合成后期/分裂期(G2/M期)的DNA百分比为38.89％,与其对照的亲本AsPC-1细胞百分比为22.02％,差异有统计学意义(P＜0.001);平板细胞克隆形成实验发现SPINK1基因上调的AsPC-1细胞克隆形成率为(9.70±0.66)％,对照的亲本细胞克隆形成率为(1.23±0.31)％,差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　结论:成功构建了SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)以及SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株; SPINK1基因能明显促进人胰腺癌AsPC-1细胞的增殖能力,且能促进人胰腺癌AsPC-1细胞的克隆形成能力。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)的构建及鉴定

二、慢病毒颗粒的包装

三、SPINK1基因在SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株中的鉴定

四、SPINK1基因对胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力的影响

五、SPlNK1基因对单个胰腺癌AsPC-1细胞克隆形成能力的影响

实验讨论

结论

参考文献

综述 SPINK1／TATI与肿瘤相关性研究

攻读学位期间发表论文情况

致谢