LINC00161通过调控miR-645-IFIT2轴抑制骨肉瘤药物抗性的分子机制研究

摘要

化疗在骨肉瘤治疗中发挥了重要作用，但是该方法总体有效率为60%左右。目前骨肉瘤新辅助化疗的药物为顺铂（CDDP），阿霉素（ADM），甲氨蝶呤（MTX）和异环磷酰胺（IFO）。顺铂是目前广泛应用抗肿瘤药物之一。伴随着治疗过程的延长，骨肉瘤细胞会产生药物抗性，导致治疗的失败。顺铂耐药已经成为骨肉瘤治疗过程中的一个非常棘手的问题。耐药产生的机制十分复杂，至今仍未完全阐明。
　　骨肉瘤对化疗药物的抗性是其治疗难点。最近，越来越多证据表明长非编码RNA(lncRNAs)在肿瘤发生中发挥至关重要的作用。但参与调控骨肉瘤化疗药物抗性的lncRNAs尚未见报道。因此，我们对lncRNAs是否调控顺铂诱导骨肉瘤凋亡，如何影响药物抗性进行研究。在本研究中,我们发现在顺铂药物诱导骨肉瘤细胞凋亡的过程中，LINC00161被激活且表达上调，并证明高表达的LINC00161可以促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡。在药物抗性产生过程中，由于LINC00161的表达被抑制导致骨肉瘤细胞产生药物抗性而凋亡减少。对LINC00161如何调控骨肉瘤凋亡及药物抗性的机制进一步研究结果表明：LINC00161可以吸附内源的miR-645并且抑制其活性，进而增加骨肉瘤细胞中IFIT2表达，IFIT2蛋白可直接导致细胞凋亡。证明其机制为LINC00161通过调控miR-645-IFIT2信号通路促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡，降低顺铂抗性。因此，这些研究结果表明LINC00161是顺铂诱导骨肉瘤凋亡的重要调控因素，LINC00161-miR-645-IFIT2轴在降低骨肉瘤药物抗性中发挥重要作用。通过本研究，LINC00161可作为骨肉瘤耐药的一种生物标志物，而且还可以作为骨肉瘤治疗的靶点，这些有助于对顺铂治疗骨肉瘤及减小药物抗性提供新思路。
　　实验一 LINC00161调控顺铂诱导骨肉瘤细胞的凋亡
　　目的：
　　研究LINC00161在顺铂诱导骨肉瘤凋亡中的作用
　　方法：
　　通过RNA芯片技术筛选顺铂诱导骨肉瘤凋亡的目标LncRNAs。验证芯片检测结果，利用q-RT-PCR与Western Blot分析检测顺铂处理不同时间（0、6h、12h、24h）及不同剂量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）骨肉瘤细胞内 LINC00161的mRNA表达水平差异，凋亡标记物的表达差异。同样方法检测MG-63细胞系内LINC00161的表达情况。为了进一步明确LINC00161在顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用，在骨肉瘤细胞内通过转染敲低LINC00161表达，另一方面使LINC00161过表达，q-RT-PCR和Western Bolt检测顺铂处理24h后凋亡变化。
　　结果：
　　Western Blot结果显示随着顺铂处理剂量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）与时间（0、6h、12h、24h）的增加，骨肉瘤细胞凋亡标记物PARP及Cleaved-PARP表达增加。q-RT-PCR检测结果显示随着顺铂处理不同时间（0、6h、12h、24h）以及不同剂量（0μΜ,5μΜ，10μΜ）的增加，骨肉瘤细胞内LINC00161的mRNA水平表达上调。敲低和过表达LINC00161后，Q-RT-PCR和Western Bolt、Annexin V和 PI双染流式检测结果显示骨肉瘤细胞中LINC00161敲低后凋亡减少，LINC00161过表达后凋亡增加。
　　结论：
　　1.在顺铂诱导骨肉瘤凋亡的过程中，LINC00161的表达和凋亡存在正相关。
　　2． LINC00161对顺铂诱导骨肉瘤凋亡有促进作用。
　　实验二 LINC00161通过调控IFIT2抑制骨肉瘤细胞药物抗性
　　目的：
　　研究 LINC00161通过靶蛋白 IFIT2参与调控骨肉瘤细胞药物抗性及细胞凋亡。
　　方法：
　　构建顺铂耐药细胞株（U2OSR），利用U2OSR为对照，通过转染使U2OSR中LINC00161表达上调，q-RT-PCR和Western Blot检测骨肉瘤细胞LINC00161表达差异与凋亡相关标志物PARP及casepase-3差异。进行Annexin V和 PI双染流式、细胞克隆形成实验检测两组细胞凋亡差异。
　　iTRAQ检测与 LINC00161作用相关性最强的靶蛋白-IFIT2，Western Blot分别从顺铂处理不同时间和不同剂量两方面进行验证。证明 IFIT2蛋白是受LINC00161调控，分别对骨肉瘤细胞内 LINC00161敲低和过表达，RT-PCR检测IFIT2 mRNA变化，Western Blot检测IFIT2蛋白表达变化。
　　结果：
　　耐药株U2SR对顺铂处理产生药物抗性。耐药株（U2OSR）中转染外源性LINC00161后，可以使LINC00161表达上调，再次用顺铂处理后，耐药株顺铂的药物抗性降低，凋亡增加。
　　RT-PCR显示 IFIT2的mRNA未变化。Western Blot显示随着顺铂药物处理U2OS时间与剂量的增加，IFIT2蛋白的表达也随之升高并且发现，顺铂药物处理后的骨肉瘤细胞系（U2OS、MG63）中IFIT2蛋白表达的升高与 LINC00161表达水平密切相关。LINC00161通过上调 U2OS/U2OSR中 IFIT2的表达促进并调控药物介导的肿瘤细胞凋亡；并且，抑制 U2OS/U2OSR内源性 IFIT2的表达直接阻断了顺铂对 U2OS/U2OSR凋亡的诱导。
　　结论：
　　1.骨肉瘤细胞系耐药株中 LINC00161的低表达使骨肉瘤细胞对顺铂产生耐药性即药物抗性。
　　2. LINC00161调控了 IFIT2蛋白的表达，且 LINC00161、 IFIT2的表达水平与顺铂介导的U2OS/U2OSR凋亡密切相关。
　　3 LINC00161作用机制不影响IFIT2的mRNA水平变化。
　　实验三 LINC00161通过 miR-645-IFIT2轴影响骨肉瘤细胞的药物抗性并调控药物介导的凋亡
　　目的：
　　研究LINC00161通过调控IFIT2蛋白表达影响骨肉瘤凋亡及药物抗性的机制
　　方法：
　　用Ago2（Argonaute蛋白）抗体形成免疫沉淀蛋白，RT-PCR检测Ago2沉淀中 LINC00161表达变化。荧光素酶报告基因分析及验证LINC00161和miR-645表达相关性，检测LINC00161是否通过竞争性结合miR-645促进IFIT2的表达。在U2OS及U2OSR中通过Western Blot对 LINC00161、 miR-645及 IFIT2的表达相关性进行蛋白水平的检测，分析LINC00161调控顺铂诱导U2OS的凋亡及药物抗性的机制。
　　结果：
　　LINC00161具有类似ceRNA角色的功能，出现在Ago2复合物中，可以通过竞争性地结合miR-645。荧光素酶报告基因分析及验证实验证明miR-645可以结合在LINC00161上，Western Blot结果说明下调miR-645表达可以增强U2OS的凋亡，上调则抑制凋亡。过表达的IFIT2可以被过表达的miR-645抵消。过表达的LINC00161促进细胞凋亡的机制是通过抑制miR-645调控的。LINC00161通过竞争性结合miR-645，从而使miR-645失去对IFIT2的mRNA水平的抑制作用，最终促进IFIT2蛋白的表达并减小顺铂的耐药性。
　　结论：
　　1. LINC00161具有类似ceRNA角色的功能，可以竞争性地结合miR-645。
　　2. LINC00161通过调控miR-645-IFIT2轴影响U2OS细胞凋亡及药物抗性。

目录

声明

前言

第一部分 LINC00161调控顺铂诱导骨肉瘤细胞的凋亡

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分LINC00161通过调控IFIT2抑制骨肉瘤细胞药物抗性

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分LINC00161 通过 miR-645-IFIT2 轴影响骨肉瘤细胞的药物抗性并调控药物介导的凋亡

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述：长链非编码RNA与骨肉瘤

中英文缩略词对照

攻读博士学位期间发表的论文

致谢