Annexin7调控对体内外小鼠淋巴道转移肝癌细胞及其亚细胞组分Ezrin表达改变的影响

摘要

背景：
　　肿瘤转移是肿瘤细胞从原生肿瘤位点（也称为原生肿瘤）向次生肿瘤位点转移的过程。肿瘤转移机制非常复杂，有多重因素可以导致肿瘤转移。粘附，扩散，转移是肿瘤转移的主要三个步骤，不同基因和蛋白通路在肿瘤转移过程中的影响也不同。淋巴癌转移是一种更为复杂的过程，包含了多种影响因素，都可导致癌细胞转移至淋巴系统。所有淋巴转移的肿瘤都是恶性的，并且淋巴癌转移常常是高致死率的诱因。肝癌（HCC）作为一种全球高致死率的疾病，位列世界恶性肿瘤排行第二位，全球已有746,000位患者因肝癌而去世。HCC流行病和地方病区域集中在东亚，北非和西非，以及欧洲和美洲的一些区域。HCC最大的挑战是与高度血管瘤及显性异质多细胞系疾病相互作用，导致了传统的化疗药物无效。HCC患者的早期诊断对于提高患者的生存率及生活质量非常关键。
　　Ezrin和Annexin7（A7）在癌症转移中起到重要的作用。然而，Ezrin和A7在淋巴癌转移和肝癌转移中的研究工作并不充分。为了完善这部分工作，我们实验室致力于找到一种新型标志物，这将帮助我们在早期诊断或治疗肝癌、淋巴癌转移的疾病中提供新的靶点，这项研究也应用于评价Ezrin作为疾病诊断、预防LNM-HCC的一种生物标志物。Subcellular fraction是一种改变最多、最为高效的生物技术手段，帮助找到疾病的细胞基因和蛋白质的功能位点也有助于帮助研究这些细胞基因和蛋白的实际作用以及他们之间的相互联系。此外，Subcellular fraction也有助于寻找到低复制数目的蛋白质及分辨蛋白质的功能，并且确定它们的生物活性核酸合成过程氧化还原酶蛋白质细胞骨架信号转导通路细胞结构和核苷流动性局部粘贴等等。本研究旨在研究Ezrin表达在高淋巴癌转移细胞系(Hca-F>70%)及低淋巴转移细胞系(Hca-P<30%)，HCC细胞线性的表达及A7对Ezrin表达效果的影响。
　　目的：
　　1、了解Ezrin在淋巴道转移肝癌（LNM-HCC）在体内和体外细胞和组织中的表达规律。
　　2、研究A7对Ezrin在不同水平上的影响及在LNM-HCC体内、体外细胞功能的影响。
　　3、比较Ezrin在不同类型的LNM-HCC亚细胞组分中的表达。
　　4、评价Ezrin的在体内、体外肿瘤组织中的表达能否作为诊断和预防LNM-HCC的生物标志物。
　　方法：
　　利用同种基因型实验鼠，高淋巴癌转移肝癌细胞系（Hca-F<70%转移）和低淋巴癌转移肝癌细胞系（Hca-P>30%转移），近亲繁殖的615鼠，分别作为体内、体外模型。Hca-F和Hca-P两种细胞株用液氮复苏，并且用无菌PBS洗涤三次，将10%无菌FBS加入无菌1460细胞培养液中培养24小时，5%CO2连续通气24小时，保持温度为37℃。
　　在Hca-F细胞株中上调A7表达(A7-cDNA-Hca-F)，并且在Hca-P设计A7基因沉默细胞株(A7-shRNA-Hca-P)。Geneticin418(G418)药物400μg/μl（在细胞培养液中）使用三周，来筛选稳定转染的细胞。qRT-PCR及western blot用于证明A7基因和蛋白表达的稳定性。
　　此外，qRT-PCR、western blot、免疫细胞组织化学、免疫荧光等技术也用来检测Ezrin和Annexin7基因和蛋白质在母系细胞系上转换的表达。另外，迁徙和入侵实验也可应用于研究我们感兴趣的蛋白质对肿瘤转移现象所起的作用。
　　将不同组细胞以2 x106细胞/鼠注射到每组615鼠的足垫。将处理过的鼠饲养5周，在第五周后采集原生肿瘤和次生肿瘤组织加入苏木精伊红后研究组织形态学改变，Ezrin表达用免疫组化的方法，利用qRT-PCR和western blot对原生肿瘤和次生肿瘤进行评价，另外，血浆中的Ezrin表达用酶联免疫反应（ELISA）进行测定。
　　结果：
　　体内实验：结果表明，qRT-PCR和western blot结果显示A7稳转后，成功构建上调Hca-F细胞系（高淋巴道转移）和下调Hca-P细胞系（低淋巴道转移）。用于动物模型所构建的细胞在第10天加入A7。亚细胞成功分离后，采用哺乳动物蛋白质提取方法来提取五种亚细胞组分：细胞质、细胞膜、细胞核核膜、核仁和组蛋白带、细胞骨架。
　　在淋巴道转移性肝癌的表达中，我们发现，Ezrin表达与癌细胞转移相关Ezrin和A7在不同HCC细胞株中表现出显著差异的蛋白表达，但是，不同的亚细胞位置Ezrin和A7相关淋巴道转移水平不同;可以解释Ezrin和A7在不同的细胞中生物活性及细胞转移能力相关联。此外，增加Ezrin的表达在A7下调细胞与Ezrin表达减少与A7上调细胞呈显著相关。这些发现可以确认A7基因具有肿瘤抑制作用。此外，Ezrin表达与HCC肿瘤转移相关联、Ezrin与A7呈正相关(P<0.05)。
　　不同转移水平的淋巴转移肝癌细胞株免疫印迹分析显示 Ezrin表达在 Hca-P（低淋巴道转移）均高于Hca-F（高淋巴转移），差异显著(p=0.0046)。细胞分离分析显示Ezrin的表达高度存在于细胞质、细胞核及Hca-F的细胞骨架。然而，在细胞膜、细胞核和 Hca-P细胞骨架中 A7上调抑制 Ezrin的表达(p=0.0248)并增加迁移和入侵的能力，而 Ezrin主要定位于细胞质和细胞核中。Hca-P中A7下调细胞Ezrin表达增强(p<0.0001)。Ezrin表达主要集中于细胞质和细胞核，并且抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭。
　　体外实验︰
　　培养淋巴道转移肝癌细胞两周，将细胞注射在小鼠左足垫后五周收集每组原发性和继发性肿瘤。我们发现原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤中的节点数Hca-F组小鼠大于Hca-P组小鼠。此外，A7组原发肿瘤和淋巴结转移肿瘤节点数Hca-P低于Hca-F，Hca-P中A7下调基因后、原发肿瘤明显大于Hca-P，淋巴结转移肿瘤中的节点数无差异。苏木精和伊红染色应用于评价组织异常。结果显示，正常对照组小鼠淋巴结无组织学异常。但组织坏死见于Hca-F组小鼠和 Hca-P组小鼠A7调控组，A7上调Hca F组织异常。A7下调控Hca-P组，原发性肿瘤的组织学损伤高，但与淋巴转移组织无差异。
　　Ezrin的表达在体内实验验证体外研究结果，Ezrin表达与肝癌产生呈正相关，与 A7表达呈负相关。western blot和 RT-PCR结果显示肿瘤不同群体Ezrin表达具有差异显著(p=0.0001)以及A7表达差异显著(p=0.021)。
　　免疫组化结果显示，Ezrin高表达的Hca-P中，A7在原发性肿瘤下调，而低Ezrin表达的Hca-F中A7在继发性肿瘤上调(P=0.004).ELISA结果说明Ezrin表达在各组间差异显著（P=0.0005）。此外，Hca-P中血清Ezrin表达高于Hca-f(p=0.0090)而血清Ezrin表达在Hca-F高于Hca-P，A7上调被抑制(P=0.0010)，Ezrin在Hca-P中A7下调组表达增强。(P=0.0510)。
　　结论：
　　1、Ezrin和A7蛋白质的亚细胞位置通过淋巴道转移水平的改变而改变，也就是说，Ezrin表达和位置的确定能够帮助确定淋巴道转移肝癌的水平，这是因为Ezrin能够与这种疾病的转移和发生有关。
　　2、Ezrin可能在淋巴道转移肝癌的发生中起到很重要的作用，并且能够与A7表达相关联。
　　3、Ezrin表达能够影响A7在淋巴道转移肝细胞癌的表达。
　　4、Ezrin表达在LNM-HCC次细胞系转化中对淋巴道转移在体内和体外模型的程度直接相关。
　　5、Ezrin水平能够快速，简便，敏感的评价组织和血浆样品。
　　6、Ezrin水平能够提供一个清楚的预测，帮助决定这种处置并且选择一种适合的处理方法。
　　7、Ezrin水平能够作为一种不同的诊断和预防的生物标志物，用于评价 LNM-HCC的水平，并且能够有利于HCC疾病的早期诊断。
　　8、在高水平转移细胞里，Ezrin相对来说具有高度浓缩的细胞骨架成分表达。然而，在Hca-P细胞里，大部分位于细胞膜和细胞核中。
　　9、在高转移性细胞中Ezrin高度集中在细胞骨架。然而，在Hca-P细胞中，大部分位于细胞膜和细胞核。而较高的核定位再加上低转移细胞骨架Ezrin表达。细胞骨架依赖长丝的大小、灵活性、浓度和交联的特点，是必要的细胞外观和细胞间的相互作用。这就是在细胞骨架中Ezrin可能扮演的角色，调节肌动蛋白细胞骨架交联和细胞活动细胞迁移和侵袭。
　　10、Ezrin对于淋巴道肿瘤转移机制起重要作用。
　　11、A7与细胞支架Ezrin表达的关系是呈负相关，影响细胞迁徙和入侵，够成为对于HCC的淋巴道转移重要的因素。
　　12、A7能够抑制Ezrin表达，有可能具有肿瘤抑制行为，并且能够直接或者间接影响治疗。

目录

声明

DEDICATION

CHAPTER 1 INTRODUCTION

CHAPTER 2 MATERIALS AND METHODS

2.1. Materials

2.2. Methods:

CAPTER 3 RESULTS

3.1. In vitro module:

3.2. In Vivo Module:

CAPTER 4 DISCUSSION

Conclusion and Recommendations

参考文献

Publications

致谢

Literature Review: Ezrin as a possible Diagnostic and/or Prognostic Bio-Marker of Hepatocellular Carcinoma