Tenascin-C在急性心肌梗死早期诊断、预后评估及心肌修复中的作用研究

摘要

背景:
　　急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的发病率越来越高，严重威胁着人类健康，给全世界带来了沉重的医疗负担和经济负担。
　　对AMI的早期诊断和预后评估仍然是研究的热点和难点。冠心病是一个综合征，即从动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)到终末期心脏病的持续过程。在这一过程中，炎症免疫反应参与从初始到终末期的全过程。而Tenascin-C作为参与炎症免疫反应的一员，在冠心病的发生、发展过程中发挥重要作用。Tenascin-C是构成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的一种具有独特六聚体结构的糖蛋白，在心脏发育阶段大量表达，但在健康成年人几乎不表达，而在AMI、心肌冬眠、心肌炎、扩张型心肌病等病理状态时再次大量表达。这就提示Tenascin-C在心血管病的进展中发挥作用。
　　已有研究发现，Tenascin-C在扩张型心肌病、主动脉夹层、风湿性心脏病等心血管疾病中具有重要作用，可能成为这些疾病诊断及预后的新型标志物。Tenascin-C可以促进AS进展，而急性ST段抬高性心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，STEMI)作为AS进展、斑块由稳定变为不稳定的极端状态，那么Tenascin-C在STEMI早期诊断和预后评估方面是否起作用？本课题将在第一部分加以探讨。
　　目前AMI的常规治疗方法，包括药物治疗、介入治疗及外科手术治疗等，都没有解决心肌细胞丢失的关键问题，因此无法完全防止或逆转这种病理学过程，最终会导致心脏重塑和心力衰竭的发生。近年来在这一领域取得的一个突破性进展就是干细胞移植在AMI中的应用。础研究多数证实干细胞移植有效，但临床研究发现心脏功能改善并不显著。随着研究的深入，人们发现移植后归巢至梗死区域局部的干细胞数量较少，并且分化和生存率较低，这明显影响了干细胞移植治疗的效果。上述问题的存在，促使人们在AMI的干细胞治疗领域不断进行新的探索，以期改善治疗效果。
　　自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)取材方便，不存在伦理问题及免疫排斥反应问题，可能成为现有条件下用于AMI治疗的最佳细胞选择之一。Tenascin-C作为炎症免疫指标，除了可以作为STEMI早期诊断和预后评估的标志物外，其本身还具有促进多种细胞粘附、迁移及分化表达等作用。本课题组前期实验发现，Tenascin-C对BMMSC有保护作用及促进迁移的作用。本课题第二部分将构建AMI小鼠模型，探讨Tenascin-C在小鼠AMI后BMMSC移植治疗中的作用及机制，为改善AMI后心肌修复的疗效提供新的理论依据和治疗靶点。
　　第一部分 Tenasc in-C在急性ST段抬高性心肌梗死患者早期诊断及预后评估中的作用研究
　　目的:
　　探讨Tenascin-C在STEMI患者早期诊断及预后评估中的作用。
　　方法:
　　选择2015年6月至2016年7月大连医科大学附属第一医院心内科收治的成功行急诊经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的STEMI患者113例作为研究对象。并选择同期住院经冠状动脉造影排除冠心病诊断的患者22例作为对照组。43例STEMI患者在发病第1、2、3、5、7天抽取静脉血，测定血清Tenascin-C水平，确定其随时间变化的规律。其余的患者在发病第3天抽取静脉血，测定血清Tenascin-C水平。应用ELISA方法检测Tenascin-C、TC、TG、HDL-C、LDL-C、hs-CRP、cTnI、BNP等指标。应用GE或飞利浦公司生产的DSA机器进行冠状动脉造影及介入治疗。应用GE Vivid7超声心动图仪检测患者的心功能。所有STEMI患者随访12个月，观察主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)发生情况。使用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(M±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两之间比较采用LSD法;计数资料以百分数表示，组间比较采用X2检验。采用Spearman进行相关性分析。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线）分析确定血清Tenascin-C水平预测STEMI患者MACE发生的最佳阈值点。MACE发生率采用log-rank检验及Kaplan-Meier生存分析，并采用Cox比例风险回归模型分析预测12个月MACE发生的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.STEMI患者血清Tenascin-C水平变化规律:43例STEMI患者发病后第1、2、3、5、7天的血清Tenascin-C水平依次为(46.51±24.37)ng/ml、（66.87±34.44）ng/ml、(97.49±41.24)ng/ml、（86.89±38.06)ng/ml、（70.87±34.86)ng/ml。血清Tenascin-C在发病后第1天内开始升高，第3天达到峰值，随后逐渐下降。
　　2.STEMI患者Tenascin-C水平与hs-CRP、cTnI、BNP等因素呈正相关，相关系数分别为0.000、0.000、0.003（均有P＜0.05）;与eGFR呈负相关，相关系数为-0.002(P＜0.05)。
　　3.12个月随访结果:113例STEMI患者在12个月的随访中，失访0人，共有31例患者发MACE，其中心源性死亡6例(5.3％)、心力衰竭（心力衰竭加重）18例(15.9％)、再发心肌梗死7例(6.2％)。
　　结论:
　　检测血清Tenascin-C水平有助于早期识别和诊断AMI。STEMI患者血清Tenascin-C水平与hs-CRP、cTnI、BNP及eGFR等因素相关，对MACE的发生具有很好的预测价值，是STEMI患者12个月发生MACE的独立预测因子。
　　第二部分 Tenascin-C在急性心肌梗死小鼠心肌修复中的作用和机制研究
　　目的:
　　探讨Tenascin-C在AMI小鼠BMMSC移植治疗中的作用及机制。
　　方法:
　　选择C57BL/6小鼠进行BMMSC分离、培养、传代。通过流式细胞仪对C57BL/6小鼠BMMSC进行鉴定。制备AMI小鼠模型，并应用超声心动图及病理学方法进行评价。应用VEVO1100小动物超声系统检测AMI小鼠的心功能，评价BMMSC移植及Tenascin-C处理对AMI小鼠心功能的影响。应用计算机辅助图像分析系统(Image-Pro plus)测量并计算梗死心肌面积。ELISA法测定AMI小鼠血浆中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-12等炎症因子的水平，评价BMMSC移植及Tenascin-C处理对AMI小鼠炎症因子的影响。将GFP标记的BMMSC注射至AMI小鼠体内，1周后取心脏作冰冻切片，放至荧光显微镜下观察细胞归巢情况。采用SPSS19.0软件建立数据库并进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示;计数资料以百分数表示。各实验组与对照组之间心功能、梗死心肌面积、炎症因子水平、细胞归巢情况等均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两之间比较采用LSD法。各实验组与对照组之间存活率比较采用X2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.流式细胞仪鉴定结果显示，CD29+(96.9％)、CD34+(96.3％)、CD44+(40.9％)、CD45-(0.7％)，符合小鼠BMMSC表面抗原特点。
　　2.心梗组小鼠结扎部位心肌变薄，局部运动减弱，病理学证实局部发生纤维化;超声心动图检查证实，心梗组小鼠心功能较对照组明显减低(P＜0.05)。AMI小鼠模型成功建立。
　　3.BMMSC移植组小鼠的心功能优于对照组(P＜0.05)，Tenascin-C处理组小鼠心功能进一步改善(P＜0.05)。
　　4.BMMSC移植组小鼠的梗死心肌面积较对照组减少(P＜0.05)，Tenascin-C处理组小鼠梗死心肌面积进一步减少(P＜0.05)。
　　5.BMMSC移植组小鼠的TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-12等炎症因子的水平较对照组降低(P＜0.05)，Tenascin-C处理组小鼠上述炎症因子的水平进一步降低(P＜0.05)。
　　6.GFP标记的BMMSCs移植组小鼠的梗死心肌区域可以见到BMMSC归巢，Tenascin-C处理组小鼠的BMMSC的归巢率增加(P＜0.05)。
　　结论:
　　BMMSC移植治疗，可以改善AMI小鼠的心功能，而应用Tenascin-C进行干预，可以使AMI小鼠的心功能进一步改善。其可能的机制为Tenascin-C促进BMMSC归巢，并具有抗炎作用，进而发挥对AMI小鼠的心肌修复作用。

目录

声明

摘要

背景

第一部分 Tenascin-C在急性ST段抬高性心肌梗死患者早期诊断及预后评估中的作用研究

材料与方法

1．对象

2．方法

结果

1．入选患者临床基线资料情况

2．STEMI患者血清Tenascin-C水平变化趋势

3．STEMI患者血清Tenascin-C水平与其他因素的相关性

4．Tenascin-C水平与STEMI患者预后的关系

讨论

结论

第二部分 Tenascin-C在急性心肌梗死小鼠心肌修复中的作用和机制研究

材料与方法

1．材料与试剂

2．实验方法

3．数据处理与统计学方法

结果

1．BMMSC鉴定

2．AMI小鼠模型制作

3．Tenascin-C在BMMSC移植治疗AMI小鼠中的作用

4．术后2周各组小鼠外周血炎症因子水平变化

5．术后2周各组小鼠细胞归巢情况

讨论

结论

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究进展

缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

致谢