应答DNA损伤的果蝇miRNA鉴定及其凋亡功能初探

摘要

DNA损伤应答是机体在识别到DNA损伤信号后，启动一系列复杂的网络系统，来检测并修复受损DNA，维持基因组稳定性的一种机制。DNA双链断裂是DNA损伤中最严重的一种形式，通过招募激活ATM，迅速磷酸化下游一系列中间因子，引起细胞周期阻滞，修复受损DNA，当修复无法完成时，会诱发细胞凋亡。有研究表明，DNA损伤与非编码RNA之间存在着千丝万缕的联系。非编码RNA不具有编码蛋白的潜能，曾一度被认为是“进化的垃圾”。然而，越来越多的证据表明它在分子机制水平上所发挥的巨大作用，已成为目前研究的热点。DNA损伤可以在多个水平调节miRNA的表达，包括转录、转录后修饰及降解。例如p53可以调节部分miRNA的转录等。另一方面， miRNA也参与到DNA损伤应答的各个环节中，包括识别DNA损伤、转导损伤信号、修复受损DNA、激活细胞周期检验点和诱导细胞凋亡。DNA损伤应答机制的缺陷及基因组范围内miRNA的表达抑制是许多人类癌症的标志，因此，鉴定参与调节DNA损伤应答的miRNA显得尤为重要。于是，筛选了果蝇生物体内的这部分miRNA，并初步研究了其分子机制。首先，鉴于ATM、p53、E2f1在DNA损伤应答中的关键作用，通过RNA seq筛选了在atm、p53、e2f1突变果蝇中，DNA损伤条件下出现差异性表达的miRNA，总共得到了109个。并购置了63株miRNA的突变果蝇株，涉及到RNA-seq数据的63个miRNA，通过生存率检测和染色体断裂计数的方法，筛选出30个对DNA损伤或敏感或抵抗的miRNA突变果蝇株。考虑到DNA损伤时，E2f1和p53可以协同促进凋亡的发生，分析了RNA-seq数据，筛选出E2f1和p53各自独立调节及共同调节的miRNA，总共83个，这些miRNA存在协同调节凋亡的可能性。另外，通过caspase-3染色发现7株在DNA损伤条件下凋亡细胞增多的miRNA突变株。这些工作不仅可以使人们更好地了解miRNA与DNA损伤应答之间的功能联系，而且可以为DNA损伤应答缺陷相关的人类疾病提供新的治疗思路。

目录

声明

摘要

前言

1．1．果蝇品系

1．2．引物

1．3．实验试剂

1．4．实验仪器

2．方法

2．1．果蝇饲养

2．2．提取果蝇总RNA

2．3．反转录qPCR

2．4．生理条件下miRNA突变株的存活率

2．5．生存率计算分析

2．6．染色体断裂计数

2．7．细胞凋亡检测

2．8．果蝇基因组DNA提取

2．9．Hid蛋白诱导表达

2．10．Western Blot

实验结果

1．利用RNA-seq筛选参与DNA损伤应答的miRNA

1．2．109个miRNA在p53，e2f1和atm突变果蝇中差异性表达

1．3．qPCR结果与RNA-seq数据趋势一致

2．30株miRNA突变果蝇对DNA损伤敏感

2．1．生存率检测

2．2．DSB计数

3 受p53和E2f1调节的miRNA可能协同调节凋亡信号

4．7株miRNA突变果蝇在辐照后凋亡细胞增多

5．制备Hid蛋白抗体

讨论

结论

参考文献

综述

致谢