营养限制下圆红冬孢酵母连续培养研究

摘要

生物柴油是环境友好的可再生液体生物燃料，目前主要基于动植物油脂生产，难以大规模可持续发展。微生物油脂脂肪酸组成与植物油相近，可作为生物柴油和油脂工业的原料，然而生产成本高成为制约微生物油脂规模化生产的瓶颈。已有研究进展表明，微生物油脂合成是部分生长偶联的，导致发酵过程油脂产量不稳定。本论文建立了恒化培养系统，以产油酵母圆红冬孢酵母为模式菌株，主要研究营养限制条件下菌体生长和油脂积累特征，构建相应的模型，并进行实验验证。
　　发现低稀释率限氮培养条件有利于获得高的油脂得率和菌体油脂含量。在稀释率为0.02h-1时，油脂得率为0.18±0.03g/g，菌体油脂含量为57.1±4.8％，但油脂生产强度低，其平均值仅为0.05±0.01g/L/h。当稀释率提高到0.1h-1时，菌体油脂含量降低到40.7±5.9％，但油脂生产强度达到0.09±0.01g/L/h。因此选择稀释率为0.1h-1的条件研究培养基中C/N比对油脂积累的影响，发现高C/N比有利于油脂积累，在C/N比为237mol/mol时，菌体油脂含量达到38.1±1.0％。此外，所得油脂组成变化不大，其中性脂的棕榈酸、硬脂酸和油酸总含量在85％以上。
　　通过限碳恒化培养，确定了圆红冬孢酵母对葡萄糖的最大生物量得率和维持系数分别为0.42g/g和5.7mg/g/h，结果对设计产油酵母多级串联培养模式具有指导意义。建立了限氮恒化培养条件下油脂积累动力学模型，预测了获得最大油脂比生成速率的稀释率范围为0.05-0.09h-1，实验数据表明，在稀释率为0.08h-1时油脂比生成速率为0.058g/g/h，验证了模型的可靠性，为优化油脂合成奠定了基础。根据不同稀释率稳态时所消耗C/N比，构建了底物碳在油脂和非油生物量之间的分配模型，利用实验数据确定了模型参数:最大油脂碳得率YmaxL为0.51C-mol/C-mol，最大菌体碳得率YmaxX为0.52C-mol/C-mol，结合细胞元素平衡分析预测了促使油脂合成的临界C/N比为12.1mol/mol，利用该分配模型预测不同消耗C/N比的油脂得率，预测值为实验值的95.2-116.7％，表明模型可靠性较好。
　　限氮连续培养中，稀释率影响油脂组分、胞内可溶性蛋白及类胡萝卜素含量。中性脂含量随稀释率增高而降低，糖脂、鞘脂和磷脂含量则随稀释率增高而升高，该变化规律得到红外光谱分析数据支持。在1，725cm-1和1，745cm-1处的C=O吸收峰，以及2，852cm-1和2，923cm-1处的-CH2吸收峰，和甘油酯和脂肪酸脂相关，它们的峰面积随稀释率增加而减小。稀释率对类胡萝卜素含量影响的规律不明显，在稀释率0.02h-1时含量最高，为0.12±0.01mg/g;胞内可溶性蛋白含量随稀释率增高而提高，在0.20h-1时含量最高，为171.7±2.5mg/g。
　　最后，为提高恒化培养系统油脂生产强度耦合了细胞循环单元，在稀释率0.08h-1条件下，油脂平均生产强度达到0.86g/L/h，与相同稀释率但没有细胞循环条件下相比，生产强度提高7倍。