盐析萃取和糖析萃取发酵液中的乙偶姻

摘要

乙偶姻是一种广泛存在于自然界物质中的天然香料，亦可作为中间体或原料应用于制药、化工、液晶、涂料行业等相关产品的生产。当前的乙偶姻生产研究多侧重于菌种的筛选与改造以及发酵条件的优化，对其分离研究很少，而乙偶姻下游分离过程比较困难，限制了乙偶姻的大规模生产和使用。本课题组前期已筛选得到一株高产乙偶姻的海洋枯草芽孢杆菌，并对其发酵特性进行了初步研究。本论文在前期研究的基础上，针对发酵法生产乙偶姻的研究现状，从发酵培养基、分离、分离与发酵耦合三方面对乙偶姻的生产工艺进行了研究。
　　首先，响应面法分析金属离子对Bacillus subtilis DL01产乙偶姻的影响。利用Plackett-Burman实验考察了七种金属离子，结果发现Mo6+、Zn2+、Mg2+、Fe2+及Ni2+对乙偶姻的生成有显著影响，其中Mo6+和Mg2+对乙偶姻生成具有正效应;利用最陡爬坡实验和中心组合实验确定两种金属离子的浓度，并利用Design Expert软件进行分析，最终确定浓度为Mg2+(1.85 mmol/L)、Mo6+(3 mmol/L);利用摇瓶实验进行验证，测得乙偶姻的产量为47.79 g/L，比不添加任何金属离子的实验结果(40.14 g/L)提高了16％，比只添加Mn2+(0.05 g/L)的实验结果(41.58 g/L)提高了13％。
　　其次，对混合溶剂盐析萃取发酵液中的乙偶姻进行研究。考察了乙偶姻在不同盐析萃取体系中的分配规律，选定萃取体系为溶剂B-乙醇(8∶2，v/v)/磷酸氢二钾体系。当发酵液∶溶剂B-乙醇(8∶2，v/v)=1∶1(v/v)、磷酸氢二钾用量占发酵液的质量体积分数为100％时，乙偶姻的回收率为95.59％。当体系放大25倍，搅拌时间3 min，磷酸氢二钾占发酵液的质量体积分数为50％和75％时，回收率均达到了95％。对盐析萃取体系中的有机溶剂和盐进行回收再利用，有机溶剂重复利用一次后，乙偶姻回收率达到了85％。乙偶姻的回收率随磷酸氢二钾利用次数的增加而降低，说明回收盐中携带的杂质对于乙偶姻在两相的分配有显著影响。
　　最后，对有机溶剂糖析萃取耦合发酵生产乙偶姻的进行研究。考察了乙偶姻和葡萄糖在不同糖析萃取体系的分配情况，并通过摇瓶实验考察了有机溶剂对B.subtilis生长的抑制情况。综合乙偶姻和葡萄糖在糖析萃取体系的分配和有机溶剂的IC50，确定了毒性较小、回收率适中的乙酸乙酯体系。研究发现，体系中葡萄糖浓度、静置时间及乙酸乙酯的用量对乙偶姻分配有影响。当葡萄糖占发酵液的质量体积分数为100％，发酵液与乙酸乙酯的体积比分别为1∶2和1∶3时，回收率分别为58.31％和65.35％，下相糖的回收率接近100％，上相中检测不到色素和有机酸。选取发酵液与乙酸乙酯的体积比分别为1∶2体系放大，结果显示，放大后的效果与小试结果一致。糖析萃取下相应用于乙偶姻的发酵，乙偶姻浓度与对照组基本一致，菌体密度稍高，糖转化率略低，证实了糖析萃取耦合发酵生产乙偶姻的可行性。
　　综上所述，金属离子对于乙偶姻发酵具有重要影响。混合溶剂盐析萃发酵液中的乙偶姻具有回收率高、操作简单的优点，而糖析萃取虽然降低了乙偶姻的回收率，但是与发酵耦合使得残留营养物质得以利用，并且大大减少了废水的处理和排放。本论文取得的研究成果可为发酵法生产乙偶姻的工艺开发奠定实验基础。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 乙偶姻的性质及应用

1．1．1 乙偶姻的性质

1．1．2 乙偶姻的用途

1．2 乙偶姻的合成方法

1．2．1 化学合成法

1．2．2 微生物转化法

1．3 发酵液中乙偶姻的分离工艺研究

1．3．1 盐析萃取

1．3．3 糖析萃取

1．4 本课题的研究思路

1．4．1 本课题的研究内容

1．4．2 本课题的研究意义

2 金属离子对Bacillus subtilis DL01发酵性能影响

2．1 引言

2．2 实验材料及仪器

2．2．1 实验菌种

2．2．2 培养基

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 培养方法

2．3．2 分析方法

2．3．3 响应面优化

2．4 结果与讨论

2．4．1 PB实验结果

2．4．2 最陡爬坡(Steepest ascent)实验

2．4．3 中心组合实验(Central Composite Design，CCD)结果

2．4．4 回归模型的验证

2．5 本章小结

3 盐析萃取发酵液中的乙偶姻

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌种

3．2．2 培养基

3．2．3 实验试剂

3．2．4 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 乙偶姻发酵液的制备

3．3．2 发酵液预处理

3．3．3 盐析萃取发酵液中的乙偶姻

3．3．4 盐析萃取体系的放大

3．3．5 盐析萃取有机溶剂和盐的回收及利用

3．3．6 分析方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 乙偶姻在混合溶剂盐析萃取体系中的分配规律

3．4．2 溶剂B-乙醇／磷酸氢二钾盐析萃取放大实验

3．4．3 溶剂B-乙醇／磷酸氢二钾盐析萃取体系有机溶剂和盐的回收利用

3．5 本章小结

4 糖析萃取发酵液中的乙偶姻

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验菌种

4．2．2 培养基

4．2．3 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 有机溶剂对B．subtilis DL01毒性测定

4．3．2 有机溶剂的筛选

4．3．3 糖析萃取发酵液中的乙偶姻

4．3．4 糖析萃取与发酵耦合制备乙偶姻

4．3．5 分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 不同糖析萃取体系对发酵液中乙偶姻的分配行为初探

4．4．2有机溶剂对B．subtilis DL01的致死率

4．4．3 乙酸乙酯／葡萄糖体系对发酵液中乙偶姻的萃取分离

4．4．4 混合溶剂糖析萃取体系中乙偶姻的分配行为

4．4．5 糖析萃取与发酵耦合制备乙偶姻

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢