环境敏感型荧光染料合成及白蛋白识别研究

摘要

荧光识别技术具有灵敏度高、选择性好、方法简单、原位和实时检测等优点，已成为现代生物技术和生命科学研究中必不可少的检测手段。在蛋白质标记技术中，荧光标记法相对于其他传统标记方法具有明显的优势，越来越引起研究者的关注。
　　尿液中微量白蛋白的含量与肾脏疾病和糖尿病有关，可以作为肾脏疾病早期治疗和糖尿病强化治疗的关键指标，因此其在尿液中HSA的精确识别具有非常重要的生物学和医学意义。
　　基于扭转分子内电荷转移(twisted intramolecular charge transfer，TICT)，合成了四例对HSA有荧光响应的小分子荧光染料SA1-4，通过结构修饰使染料的发射波长在541-685nm之间。染料进入HSA的疏水空腔后，由于微环境极性的改变以及分子自由转动被抑制，荧光强度有明显增加，如染料SA4在加入2 mg/mL的HSA后荧光增强428倍。染料对HSA的识别不受其他常见蛋白质、氨基酸和阴、阳离子的干扰，且荧光强度在10 s左右即达到平衡，可实现实时识别。SA1和SA4表现出对HSA良好的灵敏性，其中SA1对HSA的检测限为0.1 mg/L，SA4对HSA的检测限可达到0.076 mg/L。更为重要的是，SA4可用于识别尿液样品中HSA的含量，其荧光强度与HSA含量具有良好的线性关系(R2=0.997)。这表明我们合成的染料可用于实际尿液样品中微量白蛋白的识别，具有很好的生物学和医学利用前景。
　　合成了两例基于TICT机理的小分子荧光探针ES1和ES2，其与HSA结合后具有off-on的荧光响应，药物取代实验证明染料与HSA结合位点是FA1 site。我们利用ES1和ES2以及一例可与HSA siteⅠ位点结合的小分子荧光染料R1，在HSA内部构建了FRET体系。该FRET体系具有较高的能量转移效率，计算表明能量供体R1与能量受体ES1或者ES2的距离为2-3 nm。该FRET体系可用于水相中Ag+的比率型识别，其对Ag+的检测限可以达到0.02 mg/L。比率型荧光探针采用两个不同波长处的荧光强度的比值作为识别信号，可以有效提高探针的灵敏度、选择性和动态响应范围。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 环境敏感型分子

1．1．1 粘度敏感

1．1．2 极性敏感

1．1．3 温度敏感

1．1．4 pH敏感

1．2 白蛋白及其识别探针

1．2．1 白蛋白介绍

1．2．2 基于方酸染料

1．2．3 基于聚集诱导荧光增强机理

1．2．4 基于粘度或极性敏感染料

1．2．5 基于分子转子

1．3 白蛋白纳米粒子

1．3．1 白蛋白纳米粒子给药系统

1．3．2 白蛋白纳米粒子的生物应用

1．4 课题的来源和研究意义

2 基于TICT机理的荧光增强型HSA探针

2．1 引言

2．2 试验部分

2．2．1 试验仪器与试剂

2．2．2 合成路线

2．2．3 中间体及染料的合成

2．2．4 光谱性质测试

2．3 结果与讨论

2．3．1 染料SA1-4的光谱数

2．3．2 染料SA1-4的对HSA的响应实验

2．3．3 染料的氨基酸及阴、阳离子选择性实验

2．3．4 蛋白质选择性实验

2．3．5 染料对HSA响应的时间函数

2．3．6 染料对HSA检测限的测定

2．3．7 染料与HSA的Job’s plot实验

2．3．8 HSA对染料的荧光寿命的影响

2．3．9 HSA的定位实验

2．3．10 染料与HSA作用后荧光增强机理的研究

2．3．11 染料SA4在实际尿液HSA识别的应用

2．4 本章小结

3 人血清白蛋白HSA内FRET体系的构建与应用

3．1 引言

3．2 试验部分

3．2．1 试验仪器与试剂

3．2．2 合成路线

3．2．3 中间体及染料的合成

3．2．4 光谱性质测试

3．3 结果与讨论

3．3．1 染料分子对HSA的荧光响应

3．3．2 染料的氨基酸及阴、阳离子干扰实验

3．3．3 蛋白质选择性实验

3．3．4 染料对HSA响应的时间函数

3．3．5 染料与HSA的Job’s plot实验

3．3．6 HSA的定位实验

3．3．7 染料对HSA检测限的测定

3．3．8 人血清白蛋白HSA内FRET体系的构建

3．3．9 HSA内FFRT体系构建的进一步验证

3．3．10 染料-蛋白质复合体系的阳离子选择性测试

3．3．11 染料-蛋白质复合体系用于比率识别Ag+

3．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢