基于FRET的神经突触活性带张力可视化探针

摘要

目的：神经突触活性带区域的张力变化和神经突触的形成、突触囊泡的胞吞、胞吐等有密切联系，对于囊泡释放过程中活性带区域张力的研究有助于了解突触传递的机制。 方法：本文设计并构建了基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的三种张力探针，分别命名为BKTS、RKTS、CKTS。它们各自包含一个张力检测器和两个位于两端的锚定蛋白。张力检测器由一段弹性的蛛丝蛋白嵌入两个荧光蛋白ECFP和YPet组成，能将张力变化转变为两个荧光蛋白之间FRET效率的变化。探针两端的特定锚定蛋白可以和活性带区域绑定。BKTS探针的氨基端优先与Rab3-interacting molecules-binding protein（RIM-BP）的SH3-Ⅰ结构域相连，羧基端与活性带区域的细胞膜相连。RKTS探针的氨基端与RIM-BP蛋白的SH3-Ⅱ和SH3-Ⅲ结构域相连，羧基端也与活性带区域的细胞膜相连。CKTS探针的两端分别通过C1结构域和KRas和活性带区域细胞膜相连。将探针各自转入神经细胞后，施加高钾溶液刺激诱发突触囊泡释放，在激光共聚焦显微镜下同时拍摄ECFP和YPet的荧光图片。Matlab编程结合Kmeans方法对YPet/ECFP的FRET ratio图片进行聚类分析。 结果：在高钾溶液作用下，BKTS、RKTS、CKTS三种张力探针的FRET ratio都发生了显著变化，而三种对照探针都没有明显的FRET改变。在囊泡释放过程中，神经末梢区域BKTS和CKTS探针的FRET ratio值不断下降，而RKTS探针的ratio值不断上升。采用Kmeans方法对ratio图片聚类后，结果显示活性带区域的张力变化趋势更加显著。说明三种探针都可以对囊泡的释放过程做出反应，而且具有很好的灵敏度；三种探针可以检测活性带区域不同部位的张力变化。Kmeans聚类方法能从神经末梢区域的张力变化中提取出活性带区域的变化，从而放大信号，更精准地描述活性带区域的张力变化情况。 结论：本文成功设计并构建了三种能够可视化检测神经突触活性带区域不同部位张力变化的FRET生物探针，从不同角度反映了活性带区域张力变化的情况，揭示了不同蛋白在囊泡释放过程中的作用，为深入研究突触传递机制提供了有效的可视化工具。

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