基于FRET原理构建AtLHT1转运底物筛选探针

摘要

【目的】为提高导向药物筛选通量,加快导向农药分子设计、合成、筛选等研发速度,构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白AtLHT1的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针作为导向农药筛选平台。【方法】构建CFP-LHT1-YFP的三明治探针,分别在大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)原核细胞和BY4741酵母细胞中进行表达、鉴定和纯化。采用荧光酶标仪和激光共聚焦检测FRET效率的变化。【结果】CFPAtLHT1-YFP融合蛋白探针纯化后,分别与供试氨基酸和草甘膦混合,供试氨基酸和草甘膦的加入导致探针蛋白的FRET比率发生明显变化,草甘膦处理使D535 nm/D480 nm升高7%~12%,其变化趋势与阳性配体甘氨酸和谷氨酸接近,而加入阴性配体精氨酸则没有明显变化。同时,FRET比率呈现底物浓度依赖。样品中分别加入1、5和30 mmol/L的草甘膦溶液,20 min后检测到D535 nm/D480 nm分别升高3%、1%和13%,阳性配体也存在FRET比率随着底物浓度上升而升高的趋势,而阴性配体变化不规则。利用光漂白法检测到氨基酸或草甘膦处理后单个酵母细胞的FRET效率发生明显变化。加入阳性对照的甘氨酸和谷氨酸后,FRET效率变化明显,其中,甘氨酸和谷氨酸的FRET效率分别达到30%和26%;加入草甘膦处理的FRET效率与谷氨酸接近,达26%;含PBS的空白对照组没有明显的FRET效率变化。【结论】AtLHT1-FRET探针可以与中性氨基酸甘氨酸和酸性氨基酸谷氨酸结合,但不结合碱性氨基酸精氨酸;FRET效率因不同底物有所差异,且具有一定的底物浓度依赖性;同时,证明了草甘膦能够被氨基酸转运蛋白AtLHT1转运。