磷酸化修饰在剪切应力调控RhoGDIα活性中的作用

摘要

目的：Rho guanine nucleotide dissociation inhibitorα(RhoGDIα)是Rho GTPases重要的负调控因子。RhoGDIα与Rho GTPases的结合直接影响细胞迁移中Rho GTPases局部激活。然而，RhoGDIα不同位点磷酸化在剪切应力诱导其亲和度变化中的作用还不明确。 方法：本文采用经典的平行平板流动腔系统对细胞施加流体剪切应力刺激，利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)探针（sl-RhoGDIα）检测剪切应力作用下RhoGDIα和Rho GTPases在人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）中的亲和度变化。构建RhoGDIα磷酸化变体（sl-S101E/S174E，sl-Y156E,sl-S101E,sl-S174E）以及非磷酸化变体（sl-S101A/S174A，sl-Y156A,sl-S101A,sl-S174A）的FRET探针，检测磷酸化在剪切应力作用下RhoGDIα与Rho GTPases亲和度变化中的作用。利用PBD-GFP探针检测HUVEC内Rac1的活性分布。FRET显微镜采集荧光图像，通过Matlab软件编程进行图像分析处理。 结果：①测序结果表明，RhoGDIα磷酸化变体探针中RhoGDIα序列的磷酸化位点成功突变为丙氨酸或谷氨酸，这些磷酸化变体探针可在HUVEC正常表达且并不影响细胞功能状态。②剪切应力作用30min后，对照组sl-RhoGDIα、sl-Y156A和sl-Y156E的FRET ratio都明显降低，且细胞下游FRETratio的下降幅度大于细胞上游。sl-Y156A的FRET ratio整体下降幅度小于对照组，而sl-Y156E的FRET ratio整体下降幅度大于对照组。③抑制PAK1激酶活性后，剪切应力下sl-RhoGDIα的FRET ratio整体下降幅度减少，上下游FRET ratio的下降幅度无明显差异。类似地，sl-S101A/S174A的FRET ratio下降幅度也小于对照组，且无上下游差异。④剪切应力下sl-S101A和sl-S174E的FRET ratio整体下降幅度小于对照组，sl-S101A和sl-S174A的FRET ratio下降幅度在细胞上下游间没有差异。⑤剪切应力作用下，PBD-GFP荧光逐渐向细胞下游聚集。过表达S101A/S174A、S174A、S101A变体后，PBD-GFP荧光向下游聚集现象消失。 结论：本文成功构建了检测RhoGDIα变体与Rho GTPases亲和度的FRET探针。剪切应力作用下，HUVEC内RhoGDIα-Rho GTPases解离主要受RhoGDIαTyr156位点磷酸化调节。而RhoGDIα-Rho GTPases亲和度极性和活化的Rac1下游聚集主要受到PAK1激酶介导的RhoGDIαSer101/Ser174位点磷酸化调节，与Tyr156位点磷酸化无关。因此，剪切应力下RhoGDIα不同磷酸化位点在调节RhoGDIα-Rho GTPases解离和亲和度极性中发挥着不同的作用，为深入理解内皮细胞应力传导机制提供了依据。

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