大肠埃希氏杆菌16S-23S rRNA基因间隔区片断分析在粪便污染源示踪上的应用

摘要

本论文为了解决近岸海域粪便污染问题，采用一种利用粪便微生物追踪其污染源的方法——微生物源示踪法。此方法中，基因型示踪技术比较可靠，结合DNA“指纹”(DNAFingerprint)技术，通过比对同种细菌表现出的遗传多样性“指纹”图谱，追踪其所在宿主或生存环境，达到污染源示踪的目的。整个实验过程包括，从粪便中分离示踪微生物(E.coli)，提取基因组DNA，进行16S-23SrRNAISRPCR扩增，PAGE电泳，以及图像数据分析，通过特异性DNA“指纹”条带找出细菌与污染源的联系，最终完成粪便污染源的示踪。 本论文总结出一套快速分离示踪微生物的方法;初步摸索到适用于本实验的16S-23SISRPCR和PAGE条件;利用PAGE构建出不同来源E.coli的DNA“指纹”图谱，通过比较E.coli共性和特异性“指纹”带，找出示踪微生物在不同来源粪便中的多态性，为进一步粪便污染源示踪研究提供理论基础和科学依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第1章概述

1.1粪便对近岸海域的污染

1.1.1粪便污染的分类

1.1.2粪便污染对近岸海域的危害

1.1.3准确示踪和控制污染源是解决粪便污染危害的关键

1.2粪便污染源示踪技术研究现状

1.2.1污染源示踪技术的分类

1.2.2微生物源示踪简介

1.3粪便污染源示踪相关技术

1.3.1示踪微生物(示踪因子)的筛选

1.3.2微生物源示踪的微生物技术

1.3.3微生物源示踪的生物化学(表型)技术

1.3.4微生物源示踪中的化学方法

1.3.5微生物源示踪的分子学(基因型)技术—DNA“指纹”技术

1.3.6聚合酶链式反应技术

1.3.7 DNA电泳技术

1.3.8本论文的设计思想

第2章示踪因子(E.coli)的分离纯化

2.1材料

2.1.1粪便标本

2.1.2培养基

2.1.3试剂

2.1.4对照标准菌株

2.1.5设备

2.2方法

2.2.1真空冷冻干燥菌种ATCC25922的恢复培养

2.2.2 E.coli的分离

2.2.3 E.coli的镜检(革兰氏染色)

2.2.4 E.coli的生化试验

2.2.5 E.coli纯化保存

2.2.6 E.coli冻存检测

2.3结果与讨论

2.3.1 ATCC25922的活化

2.3.2 E.coli的镜检结果

2.3.3 E.coli的分离结果

2.3.4 E.coli冻存检测结果

2.4小结

第3章E.coli的16S-23S ISR“指纹”图谱分析

3.1材料

3.1.1菌株

3.1.2培养基

3.1.3试剂

3.1.4引物

3.1.5溶液配制[73]

3.1.6电泳凝胶的制备

3.1.7主要仪器

3.2方法

3.2.1 E.coli基因组DNA提取

3.2.2 16S-23S ISR PCR条件摸索

3.2.3聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳

3.2.4 E.coli“指纹”图谱构建

3.3结果与讨论

3.3.1 E.coli基因组DNA提取方法比较

3.3.2 16S-23S ISR PCR条件摸索

3.3.3聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳

3.3.4 E.coli 16S-23S ISR“指纹”图谱分析

3.4小结

结语

攻读学位期间公开发表的论文

致谢

参考文献

研究生履历