我国贝类中赤潮毒素腹泻性贝毒免疫检测技术研究

摘要

腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning,DSP)是由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的一些种类产生的一类脂溶性多环醚类生物活性物质,主要成分是软海绵酸(Okadaic Acid,OA)及其衍生物。腹泻性贝毒可在贝等滤食性动物体内富集,危害食用者健康。腹泻性贝毒是世界范围内具有最严重威胁的赤潮藻毒素之一。我国近年来每年均有发现腹泻性贝毒的报道。腹泻性贝毒的主要分析方法有液相色谱法、免疫学法以及生物毒性法。
　　本文采用碳二亚胺缩合方法合成了软海绵酸与不同蛋白载体偶联物,分别用作免疫抗原和包被抗原,免疫Balb/C鼠,采用细胞融合技术,制备了抗腹泻性贝毒主要成份软海绵酸的1种多克隆抗体、2种单克隆抗体,研究了应用这些抗体发展建立软海绵酸的间接竞争酶联免疫检测和胶体金标记免疫层析检测技术。
　　结果表明:用抗OA-BSA单克隆抗体建立的间接竞争酶联免疫检测OA方法,最低检出限为31.2ng/ml,平均回收率99.8％,平均变异系数8.7％。用抗OA-BSA单克隆抗体建立的胶体金标记免疫层析快速检测OA方法,检测时间15min,检出限为500ng/ml。用抗OA-KLH多克隆抗体建立的间接竞争酶联免疫检测OA方法,海水样品加标回收率在62~114％之间,批内变异系数在22~24％之间;贝类样品加标回收率在51~78％之间,批内变异系数在1~10％之间;用3＃多克隆抗体建立的方法分析OA的检出限为0.1ng/ml,对于海水相当于10 ng/ml,对于贝类相当于50 ng/g。
　　用抗OA-KLH单克隆抗体建立的间接竞争酶联免疫检测OA方法,海水的加标平均回收率96.6％,扇贝的加标平均回收率86.2％;用1＃ OA-KLH单克隆抗体建立的分析OA的方法检出限小于0.8ng/ml,对于海水31.2ng/ml,对于贝156.2ng/g贝肉;用抗OA-KLH单克隆抗体建立的胶体金标记免疫层析快速检测OA方法,检测时间15min,检出限12ng/ml。
　　本研究建立的酶联免疫吸附分析和胶体金标记免疫层析检测贝类中软海绵酸的方法可以满足规定的20μg/100g贝肉的安全阈值,应用于贝类实际样品的分析,为我国腹泻性贝毒的监测、保障食品安全提供技术基础和快速检测产品。

目录

摘要

Abstract

引言

第1章 文献综述

1.1 简介

1.2 麻痹性贝毒

1.3 记忆缺失性贝毒

1.4 神经性贝毒

1.5 西加鱼毒

1.6 腹泻性贝毒

1.6.1 结构、化学性质及毒性

1.6.2 毒藻、毒贝及分布

1.7 赤潮毒素分析技术

1.7.1 PSP、ASP、NSP和CFP的分析技术

1.7.2 腹泻性贝毒DSP的分析技术

1.8 国内腹泻性贝毒研究现状

1.9 本研究的目的、意义及研究内容

第2章 抗软海绵酸抗体研制及性质鉴定研究

2.1 主要仪器、试剂及配制

2.1.1 仪器设备

2.1.2 试剂材料

2.1.3 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 半抗原—载体蛋白偶联物的制备

2.2.2 自由氨基测定

2.2.3 免疫小鼠

2.2.4 制备多克隆抗血清

2.2.5 酶联免疫吸附分析方法(ELISA)

2.2.6 制备单克隆抗体

2.3 实验结果

2.3.1 OA-BSA作为免疫原制备的单克隆抗体

2.3.2 OA-KLH作为免疫原制备的多克隆抗体

2.3.3 OA-KLH作为免疫原制备的单克隆抗体

2.4 讨论

第3章 软海绵酸的酶联免疫检测技术

3.1 仪器材料和试剂

3.2 主要试剂配制

3.3 方法

3.3.1 间接竞争ELISA法分析OA

3.3.2 样品添加回收率的测试

3.4 结果

3.4.1 抗OA-BSA单抗间接竞争ELISA法分析OA

3.4.2 抗OA-KLH多抗间接竞争EUSA法分析OA

3.4.3 抗OA-KLH单抗间接竞争EUSA法分析OA

3.5 讨论

第4章 软海绵酸的免疫层析检测技术

4.1 抗OA-BSA单克隆抗体建立的免疫层析检测OA技术研究

4.1.1 仪器材料和试剂

4.1.2 方法

4.1.3 结果与讨论

4.2 抗OA-KLH单克隆抗体建立的免疫层析检测OA技术研究

4.2.1 材料试剂和设备

4.2.2 实验方法和步骤

4.2.3 实验结果

4.2.4 贝类样品的测定

4.3 OA金标免疫层析快速检测卡样卡的发明制备和指标

4.3.1 操作步骤以及结果判读

4.3.2 储存及有效期

4.3.3 注意事项

4.4 讨论

4.4.1 检测原理和条件

4.4.2 检测限与食品安全阈值

4.4.3 免疫层析检测与酶联免疫检测方法的比较

4.4.4 建立免疫层析快速检测技术的关键因素

结论

参考文献

攻读学位期间公开发表论文

致谢

研究生履历