Ectoine的高效制备技术及其对酶/细胞抗逆协助作用的研究

摘要

Ectoine（1，4，5，6-四氢-2甲基-4-嘧啶羧酸）是中度嗜盐菌中普遍存在的一类重要的渗透压补偿溶质。Ectoine不但能够平衡细胞的渗透压，而且在高温、严寒、干旱、极端PH值、高压、高盐和高辐射强度等逆环境下，对酶、DNA、细胞膜以及整个细胞提供抗逆协助作用，因此在化妆品、生物制剂、酶制剂和制药等领域具有广泛的应用前景。
　　 由于Ectoine含有一个手性碳原子，很难用化学方法合成，因此利用微生物发酵提高Ectoine制备效率的问题受到重视。关于Ectoine制备效率的研究，主要集中在菌株筛选及制备工艺方面。绝大多数报道合成Ectoine的菌株在Ectoine胞内阈值与高盐浓度之间存在矛盾;采用细菌挤奶（Bacterial milking）工艺制备Ectoine，虽然能够大幅度提高Ectoine的合成量，但渗透压冲击后Ectoine的释放率不高。Ectoine的发酵技术水平一直不是很高，特别是缺少发酵过程优化控制理论依据。
　　 为了解决上述问题，本研究选用菌株Halomonas venusta DSM4743，一方面它能够耐受较高的渗透压，另一方面其胞内Ectoine浓度阈值相对较高。在1.5 mol/LNaC1浓度下分批发酵Ectoine最大合成量为3.2g/L。该菌株能够耐受渗透压冲击，采用细菌挤奶工艺制备Ectoine，6次循环后Ectoine的总合成量为14.7 g/L，Ectoine释放率高达97％。同时通过代谢流分析的方法，对H.venusta DSM4743发酵过程实现了优化控制，选择谷氨酸单钠为唯一碳氮源、谷氨酸单钠流加发酵、限量供氧，与以葡萄糖为碳源的分批发酵相比，Ectoine合成量提高了2.8倍，得率提高了2倍。在Ectoine的应用研究方面，选取麦芽淀粉酶、β-葡聚糖酶以及纤维素酶，由于在麦芽制备过程中这三种酶经过高温焙焦阶段酶活力均有不同程度的损失，造成麦芽酿造性能下降，因此考察在高温下Ectoine对这三种麦芽酶的抗逆协助作用。添加Ectoine的三种酶在80℃和90℃高温处理后，淀粉酶残余酶活力分别提高了17.6％和26.8％;β-葡聚糖酶残余酶活力分别提高了25.7％和34.6％;纤维素酶残余酶活力分别提高了57.6％和50.8％。在酶的热处理体系中添加Ectoine对上述三种酶的抗逆协助作用显著。

目录

声明

摘要

引言

第1章 文献综述

1．1 中度嗜盐菌及渗透压补偿溶质

1．1．1 中度嗜盐菌

1．1．2 渗透压补偿溶质

1．1．3 Ectoine基本性质及鉴定方法

1．1．4 Ectoine的生物功能

1．1．5 Ectoine的抗逆协助机制

1．2 Ectoine的应用

1．3 Ectoine制备技术

1．3．1 分批发酵及分批补料发酵

1．3．2 细菌挤奶

1．3．3 生长细胞与非生长细胞两阶段制备法

1．4 Ectoine合成调节

1．4．1 Ectoine合成途径

1．4．2 Ectoine代谢调控策略

1．5 本文立题背景和研究内容

第2章 Halomonas venusta DSM 4743合成Ectoine条件优化及细菌挤奶工艺制备Ectoine

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 菌株培养

2．2．2 Ectoine的高效液相色谱法(HPLC)测定

2．2．3 Ectoine的13C-NMR鉴定

2．2．4 细胞干重的测定

2．2．5 Ectoine分批发酵

2．2．6 细菌挤奶制备Ectoine

2．3 结果与讨论

2．3．1 NaCl诱导下Ectoine的合成

2．3．2 NaCl浓度对Ectoine合成的影响

2．3．3 酵母膏添加量对Ectoine合成的影响

2．3．4 不同碳源对Ectoine合成的影响

2．3．5 优化条件下Ectoine发酵进程

2．3．6 细菌挤奶制备Ectoine

2．3．7 讨论

2．3．8 结论

第3章 Ectoine发酵代谢流分析及其过程优化控制

3．1 实验材料

3．1．1 菌种及仪器设备

3．1．2 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 发酵罐分批发酵方法

3．2．2 Ectoine的HPLC测定

3．2．3 氨基酸组成测定

3．3 结果与讨论

3．3．1 Ectoine代谢网络建立

3．3．2 代谢流平衡方程

3．3．3 葡萄糖为碳源的Ectoine发酵代谢流分布

3．3．4 谷氨酸单钠为碳源的Ectoine发酵代谢流分布

3．3．5 基于代谢流分析的发酵过程优化控制

3．3．6 讨论

3．3．7 结论

第4章 Ectoine对酶抗逆协助作用的研究

4．1 实验材料

4．1．1 材料

4．1．2 试剂及仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 淀粉酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶粗酶液的提取

4．2．2 淀粉酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶活力测定

4．2．3 残余酶活力的测定

4．2．4 Eetoine在高温下对麦芽酶的抗逆协助作用

4．3 结果与讨论

4．3．1 Ectoine对高温下淀粉酶的抗逆协助作用

4．3．2 Ectoine对高温下β-葡聚糖酶的抗逆协助作用

4．3．3 Ectoine对高温下纤维素酶的抗逆协助作用

4．3．4 讨论

4．3．5 结论

结论

参考文献

攻读学位期间公开发表论文

致谢

作者简介