人蛔虫体腔液对肺癌细胞株（A549）IL-6、TGF-β分泌的影响

摘要

目的： 用人蛔虫体腔液(Ascaris body fluid，ABF)干预体外培养的人肺腺癌细胞株A549，探讨ABF对A549细胞分泌IL-6、TGF-β的影响，即ABF浓度和作用时间与IL-6、TGF-β分泌水平的关系，以及ABF影响下靶细胞IL-6、TGF-β分泌与细胞凋亡的关系。 方法： 1.绘制A549细胞生长曲线：取对数生长期的A549细胞常规消化计数，准确将细胞分别接种于24孔培养板中，每日取3孔计数，连续观察7天。掌握靶细胞基本生长规律。 2.ABF制备：对蛔虫感染者一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg／Kg体重)，服药后从粪便中收集蛔虫成虫。取完整的蛔虫，经自来水、无菌生理盐水洗净后，滤纸吸干，持镊子夹住前端，使之垂直于消毒离心管上，在虫体末端剪一小口，体液自然流出，逐条收集。收集的液体在10，000 ×g离,b30分钟，取上清，经O.45μm醋酸纤维膜过滤除菌，用核酸蛋白仪测蛋白含量为3370μg/ml，置-30℃储藏备用。 3.细胞毒性实验：取对数生长期的A549细胞常规消化计数，准确将细胞分别接种于96孔培养板中，将起始浓度为3370μg/ml的ABF倍比稀释至13.5μg／ml，用MTT法检测细胞活性，取细胞存活率大于50％的ABF浓度为诱导实验的浓度范围。 4.细胞干预实验：依据细胞毒性实验的结果，将干预物ABF以10 u咖l、100μg/ml、300μ/ml三个浓度作用A549细胞，在干预1h，3h，5h，9h后收取各时间段不同作用浓度的细胞培养上清，用EL,ISA法检测IL-6、TGF-β表达水平。同时收取细胞进行HE染色，观察细胞凋亡情况，采用HE染色盲法计数计算细胞凋亡率。 5.DNA琼脂糖凝胶电泳：取浓度100μg／mL的ABF作用A549细胞为实验组，对照组加入10％FCS+RPMl1640的培养液，置37℃，5％CO<,2>的细胞培养箱中培养5小时。分别收集细胞样本，用酚抽提法提取DNA，取DNA样本在2％琼脂糖凝胶中、电压为5V／cm电泳2小时，检测细胞凋 亡。 6．统计学分析：用SPSS11.5处理各组实验数据，对上述实验结果进行统计学分析，HE染色计算凋亡率所得数据做平方根反正弦转换，然后进行方差分析，样本均数的两两比较用q检验。ELISA数据直接进行方差分析，样本均数的两两比较用q检验。 结果： 1．细胞生长曲线：细胞从第二天开始进入对数生长期，在第五天生长最为旺盛，之后增殖减慢逐渐进入平台期。 2．细胞毒性实验：当浓度为300μg／ml时细胞存活率为55.6％，因此取300μg／ml为诱导A549细胞的浓度上限。 3．ELISA检测：各诱导组的IL-6水平均低于对照组，在同一时间段内，各诱导组IL-6水平随ABF浓度的增加而降低，且与对照组有显著性差异(P<0.05)；但10μg／ml浓度组与300μg／ml浓度组之间并无显著性差异。在同一诱导浓度内，IL-6水平随ABF作用时间延长而降低，且3、5、9小时组明显低于1小时组，但3小时组与5小时组并无显著性差异(P>0.05)。在同一时间段内，TGF-β水平随ABF浓度增加而增加，但100μg／ml浓度组与300μg／ml浓度组之间并无显著性差异(P>0.05)。而在同一浓度内，TGF-β水平随ABF作用的时间的变化，在1、3、5小时之间无显著性差异，但与9小时组相比均有显著性差异(P<0.05)。 4．HE染色：显微镜下观察，经ABF诱导后的A549细胞呈现典型凋亡形态，如细胞体积变小，细胞核变小、深染，呈深蓝色，核固缩，碎裂。各诱导组细胞凋亡率均高于对照组。在同一时间段内，细胞凋亡率随ABF的浓度增加而增加，100μg／ml组的细胞凋亡率最高，但10μg／ml浓度组与300μg／ml浓度组之间并无显著性差异。在同一浓度内，细胞凋亡率随时间延长而增加。 5.DNA琼脂糖凝胶电泳：经ABF诱导后的A549细胞，其DNA经琼脂糖凝胶电泳出现具有凋亡特征的梯状条带，而对照组未见此现象。 结论： 1.ABF诱导A549细胞过程中发生了TGF-β和IL-β水平的变化。在同一时间段内，TGF-β水平随ABF浓度增加而增加，IL-6水平随ABF浓度的增加而降低；在同一诱导浓度内，IL-6水平随ABF作用时间延长而降低，TGF-β水平随ABF作用的时间的变化，在1、3、5小时之间无显著性差异，但与9小时组相比均有显著性差异。 2.ABF影响人肺腺癌细胞A549 TGF-β和IL-6分泌的同时，亦发生了细胞凋亡现象。 3.ABF干预A549细胞发生的TGF-β和IL-6水平的变化和细胞凋亡在一定范围内呈浓度和作用时间依赖性，在同一时间段内当ABF浓度增加时，TGF-β水平是上升，而IL-6水平下降，靶细胞凋亡率增加；在同一浓度下随ABF作用时间的延长，IL-6水平下降，而TGF-β水平随ABF作用时间的变化有所不同，靶细胞凋亡率增加，提示靶细胞发生凋亡与TGF-β、IL-6水平的变化有关。

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前言

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结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢

文献综述 细胞因子IL-6、TGF-β与肿瘤的关系