慢性粒细胞白血病总RNA转染树突状细胞介导的抗慢性粒细胞白血病作用的体外研究

摘要

目的：探讨人慢性粒细胞白血病(CML)总RNA体外转染自体慢性粒细胞白血病-树突状细胞(CML-DC)，并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫反应，为CML疫苗的临床研究提供理论依据。 方法：利用10例CML患者骨髓单个核细胞(BMMNC),加入重组白介素-4(rhIL-4)、重组粒单细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组肿瘤坏死因子(rhTNF-α)等细胞因子联合培养诱导CML-DC。用Trizol法提取CML-BMMNC的总RNA，用CML-BMMNC制备肿瘤冻融抗原。于CML-DC培养第5天，将CML-DC分成4组，比较总RNA经脂质体转染的CML-DC，总RNA不经脂质体转染的CML-DC，CML肿瘤冻融抗原负载的CML-DC，未负载抗原的CML-DC共4组分别致敏T淋巴细胞产生的CTL杀伤活性，另设以IL-2培养的T淋巴细胞为空白对照组。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTF法)检测不同方法产生的CTL杀伤CML细胞的作用；用倒置显微镜观察CML-DC诱导前后形态学变化；用流式细胞仪器检测CML-DC诱导前后CD1 α、CD83表型变化；用染色体G显带技术及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其染色体核型及Bcr-ab1融合基因的表达。 结果：CML BMMNC诱导成CML-DC，CD1 α、CD83表型诱导前均在5％以下，诱导培养成熟的CML-DC细胞CD1a、CD83阳性细胞分别占(20.15±3.36)％、(25.37±2.72)％较前均明显增高。诱导的CML-DC均存在Bcr-ab1基因带和Ph1染色体，提示CML-DC为白血病源性。总RNA经脂质体转染CML-DC、总RNA不经脂质体转染CML-DC、CML肿瘤冻融抗原负载CML-DC、未负载抗原CML-DC分别致敏的CTL及IL-2培养的T淋巴细胞在效：靶比为20.1时的杀伤效率分别为74.67±3.54％、36.45±3.02％、51.07±3.67％、31.52±1.82％、10.62±3.17％。总RNA经脂质体转染的DC所诱导的CTL杀伤活性最强，与后四者杀伤活性有显著性差异。未负载抗原的CML-DC所诱导的CTL与经IL-2培养的T细胞组相比，杀伤率明显增高。 结论：CML BMMNC经rhIL-4、rhGM--CSF、TNF-α联合培养诱导的CML-DC，CD1a、CD83均明显增高，此类DC既具有CML白血病源性，又具有DC细胞的特性，能诱导特异性CTL杀伤作用。此外，总RNA经脂质体转染的CML-DC诱导的CTL杀伤性对CML细胞的杀伤作用最强。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

2章材料和方法

2.1主要实验仪器和器材

2.2主要试剂

2.3实验对象

2.4慢性粒细胞骨髓单个核细胞的提取，CML-Dc培养及表型鉴定

2.4.1慢性粒细胞白血病患者骨髓单个核细胞的提取

2.4.2慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞的培养

2.4.3流式细胞仪对树突状细胞诱导前后表型的鉴定

2.5慢性粒慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞Ph1染色体检查

2.5.1CML-DG标本制备

2.5.2G显带标本制备

2.6细胞诱导前后Bcr-abl融合基因的RT-PCR检测

2.7慢性粒细胞白血病肿瘤抗原负载未成熟树突状细胞

2.8慢性粒细胞白血病肿瘤冻融抗原的制备

2.9慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞总RNA的提取

2.10转染

2.11慢性粒细胞白血病总RNA直接负载CML-DC

2.12慢性粒细胞白血病肿瘤冻融抗原负载CML-DC

2.13效应细胞即肿瘤特异性CTL培养及鉴定

2.14靶细胞的冻存与复苏

2.14.1靶细胞的冻存

2.14.2靶细胞的复苏

2.15 MTT法测定CTL细胞毒活力

2.16统计学分析

第3章结果

3.1 CML DC形态学观察及细胞免疫表型检测

3.1.1倒置显微镜观察

3.1.2慢性粒细胞白血病骨髓来源的DC的免疫表型分析（见表3.1,图3.5,3.6）

3.1.3诱导的慢性粒细胞白血病树突状细胞染色体核型检测(见图3.7)

3.1.4诱导出的慢性粒细胞白血病树突状细胞Bcr-abl检测(见图3.8)

3.2CTL细胞CD3表达率为(73.21±2.52)%(见图3.9)

3.3总RNA的质量检测(见图3.10)

3.4各组的细胞杀伤效应(见表3.2)

3.5未负载DC的CTL组与经IL-2培养的T细胞组杀伤效应(见表3.3)

3.6转染总RNA的DC诱导的CTL与负载裸总RNA的DC的CTL杀伤效应(见表3.4)

第4章讨论

4.1树突状细胞与慢性粒细胞白血病

4.2慢性粒细胞来源的树突状细胞的细胞毒作用

4.3 CML-DC负载白血病抗原的意义

4.4总RNA转染树突状细胞所产生的细胞毒杀伤作用

4.5裸总RNA转染树突状细胞所产生的细胞毒杀伤作用

第5章结论

致 谢

参考文献

综述:树突状细胞疫苗诱导抗慢性粒细胞白血病免疫治疗

攻读学位期间的研究成果