心肌营养素-1在心肌缺血再灌注损伤中的作用及信号转导

摘要

研究背景与总体思路: 大量的基础和临床研究证实，缺血心肌再灌注后，缺血心肌细胞损伤会加重，包括心肌功能进一步受损、代谢异常以及心肌超微结构的改变进一步加重，即心肌缺血再灌注(I／R)损伤。再灌注损伤机制复杂，可通过多种途径产生，氧自由基的作用是I／R的重要发病环节，是细胞衰老和死亡的重要因素。心肌细胞凋亡与I／R密切相关，线粒体膜通透性转变孔(mPTP)具有调节心肌细胞凋亡的作用，在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位△Ψm的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，导致电子传递链中断，氧化磷酸化停止，细胞内氧自由基水平上升，ATP水平下降，改变细胞电化学氧化还原状态以及释放Caspase激活物，直接导致细胞凋亡或死亡。稳定线粒体膜电位△Ψm，阻止线粒体膜通透性改变，可以逆转濒临凋亡的心肌细胞。因此研究心肌细胞凋亡的保护因子是当前的热点之一。 CT-1是新近从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆出的一种细胞因子，主要表达于心肌细胞和心肌成纤维细胞，它参与调节心脏正常生理过程，具有促进心脏正常发育和促使细胞存活的作用。作为IL-6超家族成员，CT-1与受体gp130和或LIFR β结合后，具有IL-6样作用，合成急性期反应蛋白，产生心肌保护作用。研究证实，急性心梗后缺血心肌CT-1表达明显增多，从而减少心肌细胞的死亡丢失，促进残余细胞的存活，并使成纤维细胞迁徙促进梗死区愈合，保护心功能。体外研究发现CT-1能增强新生大鼠心肌细胞在无血清培养基中的存活，CT-1诱导热休克蛋白hsp70和hsp90的过度表达，后者对培养新生心肌细胞的热休克或缺血缺氧的刺激有保护作用。以上均表明CT-1与心肌的损伤和功能有着密切的关系。 为此设想，CT-1亦可能在大鼠急性I／R损伤心肌细胞代谢和功能的损害中发挥作用，并可能作为细胞内一种内源性保护物质，对减轻I／R损伤起着重要的保护作用。前期研究发现，CT-1通过JAK／STAT3信号通路介导高静水压促心肌成纤维细胞增殖，ERK1／2通路抑制其促增殖作用，P13K信号通路则不参与CT-1的促心肌成纤维细胞增殖作用。那么，CT-1在心肌缺血和再灌注损伤中的作用机制如何，以及通过哪些信号转导途径发挥作用，如何发挥作用，尚需进一步的研究来证实。因此本研究： 首先利用离体Langendorff缺血再灌注心脏，通过观察CT-1对离体缺血再灌注心脏心肌梗死范围，再灌注心律失常，心功能的影响，以及心肌的病理改变等，心肌eNOSmRNA和iNOSmRNA表达的变化，并利用信号通路阻断剂阻断CT-1的作用；从离体器官水平，研究CT-1是否对缺血再灌注心脏的心肌损伤具有直接的保护作用，并初步探讨CT-1的作用机制。 其次利用离体培养的心肌细胞急性缺氧-复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤，通过观察CT-1对缺氧-复氧后心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡的影响，及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(△Ψm)、心肌细胞ROS等的变化，证实CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。并应用信号通路阻断剂及细胞因子信号抑制子-1(SOCS1)反义寡核苷酸技术，进一步阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制及信号转导途径；通过检测分化与凋亡相关基因的表达，从细胞和分子水平，论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。 第一部分：CT-1对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用及机制探讨 目的:利用Langendorff灌流装置，建立离体大鼠I／R心脏模型，通过检测心肌梗死范围、心律失常、心肌酶学、心功能及病理改变，评估CT-1对缺血再灌注损伤大鼠心脏的作用；同时检测心肌eNOSmRNA表达和iNOSmRNA表达，初步探讨CT-1的作用机制。从离体整体心脏水平，探讨CT-1是否对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用，以及保护的机制如何。 第二部分CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用机制及信号转导 目的:本部分以体外培养的心肌细胞为研究对象，利用心肌细胞急性缺氧复氧模拟心肌缺血再灌注损伤，通过观察CT-1对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡，心肌肌酸激酶等的影响，及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(△Ψm)、心肌细胞ROS、NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1蛋白表达等的变化，进一步探讨CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。通过使用CT-1信号通路阻断剂LY294002，PD98059及信号抑制子(SOCS1)反义寡核苷酸(ASODN)转染心肌细胞，从细胞和分子水平阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的信号通路(包括激活磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)P13K／Akt／糖原合成酶激酶(GSK-3 β)即PI3K／Akt／GSK-3β，PI3K／Akt／eNOS，ERR1／2，SOCS1／STAT3途径。通过检测分化与凋亡相关基因的表达，论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

第1章心肌营养素-1对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用及机制探讨

材料与方法

结果

讨论

结论

第2章心肌营养素1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的作用机制及信号转导

第一节PRK1/2,PI3K/Akt/GSK-3β，PI3K/Akt/eNOS途径介导的CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用

方法

结果

第二节信号抑制子SOCS1、STAT3介导CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

致谢

参考文献

附录A 图片

附录B 文献综述：国外医学老年医学分册.2007.28.(1):5-8 心肌营养素-1与心肌梗死后心肌修复

攻读学位期间的研究成果