小鼠胚胎干细胞诱导的血管细胞联合种植在PLGA上初步构建出血管组织

摘要

目的：在我们已有小鼠胚胎干细胞诱导且经过RT-PCR和免疫组化鉴定血管平滑肌细胞(VSMc)和内皮细胞(EC)种子细胞的基础上，现在探索用诱导的内皮细胞和血管平滑肌细胞，联合种植在经明胶浸润处理的聚丙交酯/乙交酯(PLGA)静电纺丝材料上，进行体外构建小管径组织工程血管。 方法：①先将PLGA用1％明胶处理，并测量明胶浸润处理前后PLGA的接触角。②在明胶处理与否的PLGA片上种植血管平滑肌细胞，60分钟后即用甲苯胺蓝染色法观察材料对细胞的亲和力：用MTT、扫描电镜材料观察经培养1天，3天后细胞在材料上的生长情况。③在片状PLGA材料一侧隔日种植血管平滑肌细胞1次，3天共2次，再于另外一侧种植内皮细胞1次，并进行联合培养2天后，作H&E和免疫组化检查。④将联合种植了血管平滑肌细胞和内皮细胞的PLGA裹成直经约1mm管状包埋于4周龄的裸鼠皮下，分别于3天，1，3周取出进行HE染色和免疫组化检查。⑤同时用放射免疫法测定单纯种植1次血管平滑肌细胞的A组，单纯种植内皮细胞的B组，联合种植了平滑肌和内皮细胞的c组这三组培养液中内皮素含量。 结果：①处理前的接触角是88.5°，处理后61.5°。②甲苯胺蓝染色见血管平滑肌细胞在材料上密集、均匀分布：扫描电镜观察到1小时细胞开始延展，1天开始长入孔隙中，3天呈多层分布，无序状生长；MTT检测支架上细胞在3天内的增殖情况等同于培养板。③H&E和免疫组化见材料两侧分别分布着血管平滑肌细胞和内皮。④包埋3周后材料结构仍存在，未被降解吸收。在材料周围包裹结缔组织，管壁外侧有多层血管平滑肌细胞，内侧有内皮细胞。⑤内皮素含量在A组为0.82±0.37 pg/ml，B组5.59±1.23 pg/ml，C组4.51±0.59 pg/ml。 结论：①用1％明胶浸润包被处理PLGA后能改善材料的细胞亲和力；②在PLGA上联合种植血管细胞的方法初步构建了具有血管平滑肌细胞和内皮细胞的组织工程血管片；③包埋裸鼠皮下后形成了具有三层细胞结构的组织工程血管。