基因芯片技术筛选不同发育阶段人表皮干细胞差异表达基因的研究

摘要

目的：利用基因芯片技术筛选不同发育阶段人表皮干细胞差异表达基因，分析不同发育阶段人表皮干细胞基因表达变化的特征及其可能的生物学意义，为进一步探讨表皮干细胞增殖分化调控机制提供新思路和线索。 方法：收集28～32周胎儿，4～12周岁少儿、35～55岁成年人3组正常人皮肤标本，采用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮，Ⅳ型胶原快速粘附法分离、纯化人表皮干细胞，免疫细胞化学染色法分别行β1整合素、K19单抗检测鉴定。将21522条Oligo DNA用点样仪点制在一张经过化学修饰的载玻片上制备成表达谱芯片。按Trizol一步法分别提取各组细胞总RNA，琼脂糖甲醛变性胶电泳质检。通过逆转录方法将Cy3荧光标记到Human对照组DNA上（以人类基因作为共同参照），将Cy5荧光标记到实验组（胎儿组、少儿组与成人组）cDNA上，制成探针，并与表达谱芯片进行杂交及扫描芯片荧光信号图像。采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，以2倍差异表达值（Ratio）筛选差异表达基因。选择明显上调或抑制的基因，用Real time RT-PCR技术对相关的基因作进一步验证。 结果：基因芯片高通量地揭示了胎儿、少儿和成人组表皮干细胞的遗传信息。成人组与少儿组样本相比，差异表达基因有1808条，其中上调的基因有1089条，下调的基因有719条；已知基因1462条（已在Gene Bank登录），未知基因346条。少儿与胎儿组样本相比，差异表达基因有4534条，其中上调的基因有1783条，下调的基因有2751条；已知基因3577条（已在Gene Bank登录），未知基因957条。对筛选出的成人与少儿，少儿与胎儿的差异表达基因结果在Molecu-le Annotation System进行了Go分类的统计分析，根据基因功能分类，成人与少儿差异表达基因可分为128类，少儿与胎儿差异表达基因可分为216类，因一个基因可以有多个功能，其总数大于筛选出的差异基因总和。其中1104条基因在胎儿、少儿与成人组样本中呈持续差异表达，根据基因功能分为32类。差异基因涉及蛋白质翻译、能量合成和DNA复制，均与表皮干细胞的发育进程密切相关。实验检测到持续差异表达基因中有94条基因表达差异呈持续上调，75条表达差异呈持续下调。表达持续上调的基因类别主要为核苷酸结合蛋白基因（如NM_005381、NM_024045）、蛋白质折叠结合相关基因（如NM_002157、NM_006260）、锌离子结合蛋白基因和ATP结合蛋白基因等。表达持续下调的基因类别主要为GTP结合蛋白基因、序列特异性DNA结合蛋白基因（如NM_005253、NM_001421）、促分裂原活化蛋白激酶基因（如NM_002746、NM_002754）、核仁蛋白家族基因和细胞外基质结构蛋白基因等。Real time RT-PCR结果显示胎儿、少儿与成人样本中TUBGCP3表达量持续增高，而FOSL2的表达量持续降低，与芯片筛选结果相一致，说明本次基因芯片筛查结果真实、可靠。 结论：体外培养的胎儿、少儿与成人表皮干细胞基因表达谱有明显不同，伴随人体生长发育，成人相对于少儿、少儿相对于胎儿表皮干细胞，一些与细胞成熟相关的细胞骨架结构蛋白基因上调，而如GTP结合蛋白基因、序列特异性DNA结合蛋白基因和MAKP活性蛋白基因等一些与细胞增殖分化相关基因下调。提示随着年龄的增长，表皮干细胞在维持细胞形态和保持细胞内部结构特性以及细胞稳态的维持上更加成熟，而其增殖分化的能力可能呈现下降趋势。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第1章前言

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1标本

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1表皮干细胞的分离培养

2.2.2免疫细胞化学染色检测

2.2.3表皮干细胞RNA的提取

2.2.4细胞RNA琼脂糖甲醛变性胶电泳质检

2.2.5芯片制备

2.2.6细胞RNA的荧光标记

2.2.7芯片杂交与清洗

2.2.8芯片扫描及图像的采集

2.2.9对芯片筛选的差异表达基因TUBGCP3和FOSL2进行RealTime RT-PCR验证分析

2.2.10数据检测与分析

第3章实验结果

3.1表皮干细胞分离培养结果

3.2β1整合素、K19免疫细胞化学染色检测结果

3.3总RNA抽提结果

3.4芯片扫描结果

3.5生物信息分析

3.6 RealTime RT-PCR验证分析结果

第4章讨论

第5章结论

致谢

参考文献

综述:表皮干细胞生物学特性相关研究

攻读学位期间的研究成果