IL-1β和PGE在烟雾吸入性损伤修复中作用的实验研究

摘要

研究背景与总体思路：
　　 吸入性损伤是烧伤病人常见的合并损伤,其中烟雾是最常见的致伤因素。当吸入性损伤出现后机体将立即启动损伤修复过程以保证肺的正常功能,损伤后可能会完全修复,也可能会导致气道纤维化、瘢痕形成致气道狭窄,从而引起患者呼吸困难,生活质量严重下降。怎样尽早促进吸入性损伤修复和预防损伤修复后气道纤维化、瘢痕形成致气道狭窄?是一个临床上非常棘手的问题,目前研究热点主要集中在细胞周期调控、细胞外基质及细胞因子在气道粘膜损伤修复过程中的作用。气道损伤修复是一个非常复杂的过程,多种细胞类型主要为气道上皮细胞和成纤维细胞、多种炎症介质和细胞外基质成分共同参与,这个过程中可出现纤维化、瘢痕形成,导致气道狭窄。目前研究表明在气道损伤修复过程中,炎症反应是一个必不可少的部分,它可以促进损伤尽早修复,但是过度炎症反应与损伤修复的后果,尤其是与纤维化瘢痕形成密切相关;另一方面,在胎儿的损伤修复中研究发现减少对损伤的炎症反应与缺乏瘢痕形成和纤维化的再生修复过程相关。以往研究还表明成纤维细胞是细胞外基质的主要来源,它的募集、聚集与激活影响损伤后组织的正常愈合和纤维化形成的过程,在损伤部位,炎症与成纤维细胞活性的关系可能对损伤修复的最终后果和瘢痕形成程度起重要作用,因此,研究炎症因子与气道成纤维细胞在气道粘膜损伤修复中的作用,对促进气道损伤早日修复及防止损伤修复后气道狭窄具有重要意义。
　　 白介素-1β(IL-1β),是一种多功能的生物活性物质,被认为是早期炎症反应中重要的炎症介质,可由各种细胞包括上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞分泌的一种细胞因子。在损伤部位IL-1β分泌可刺激IL-6、IL-8、PGE2分泌,这些炎症介质是使损伤部位活动协调的整合炎症反应中的一个部分。前列腺素E2(PGE2)是一个辅助性炎症介质,通过环氧合酶合成、由PGE2合酶激活、被多种酶包括脱氢酶降解。在组织修复中,PGE2是参与调节炎症与纤维化的重要炎症介质,它通过调节成纤维细胞迁移率来抑制成纤维细胞趋化性,通过阻断成纤维细胞增殖和胶原产生来影响成纤维细胞在损伤修复中基质收缩与重构中的作用。PGE2在损伤修复过程中早、晚期阶段表达,它能抑制纤维化反应,包括胶原产生、细胞外基质收缩及成纤维细胞增殖,还能刺激上皮细胞迁移,参与损伤修复这一阶段。为此我们设想,IL-1β和PGE2在气道粘膜损伤修复过程中可能起重要作用,可能为临床上判断气道粘膜损伤修复过程不同阶段提供新的手段;对促进气道粘膜损伤尽早修复和预防损伤修复后气道纤维化、瘢痕形成致气道狭窄提供一定的理论依据。
　　 本研究的总体思路为:
　　 首先,建立烟雾吸入性损伤修复动物(新西兰白兔)模型,通过检测气道分泌物IL-1β、PGE2和病理改变以及IL-1βmRNA、COX-2mRNA表达,旨在明确
　　 ①损伤修复过程中不同阶段(损伤期和修复期);
　　 ②IL-1β、PGE2在烟雾吸入气道粘膜损伤修复过程中不同时间点水平变化与病理改变的关系,可能为临床上判断气道粘膜损伤修复过程不同阶段提供检测手段;
　　 ③IL-1βmRNA、COX-2mRNA表达变化与病理改变之间的关系。
　　 然后,根据上部分的研究结果,以原代气道成纤维细胞为研究对象,观察IL-1β和PGE2之间的相互关系,利用ELISA法测定PGE2水平和Western印迹法检测各项指标COX-2、mPGES1、EP2与15-PGDH表达。从细胞和分子生物学水平,研究IL-1β对气道成纤维细胞PGE2表达的影响,进一步探讨IL-1β、PGE2在吸入性损伤修复中的作用。
　　 第一部分(体内实验)、烟雾吸入性损伤修复模型IL-1β和PGE2表达的变化
　　 目的:探讨IL-1β和PGE2在新西兰白兔烟雾吸入性损伤气道修复中表达变化,及其与病理改变的关系。
　　 方法：新西兰白兔36只,随机分为正常对照组、烟雾吸入性损伤后第1、4、7、14和21d组,共6组,各组依次收集气道分泌物和常规苏木素伊红(HE)染色做病理切片,应用ELISA和RT-PCR方法检测各组IL-1β、PGE2及COX-2表达。建立烟雾吸入性损伤修复模型,光镜下观察烟雾吸入对实验兔气管、肺组织的病理变化。
　　 结果：
　　 ①病理变化表明烟雾吸入性损伤第1、4、7d组以损伤后炎症反应为主(损伤期),第14、21d组以损伤后修复为主(修复期),这表明烟雾吸入性损伤修复模型成功建立;
　　 ②ELISA结果表明:IL-1β含量在烟雾吸入性损伤后第1d立即升高,至第21d最低,损伤期第7d组(253.3±96.2)与修复期第14d组(96.2±67.8)比较有显著差异(P＜0.01);PGE2含量在烟雾吸入性损伤后第1d立即升高,至第21d达到顶峰,修复期第14d组(85521±24015)与损伤期第7d组(32486±19811)比较有显著差异(P＜0.01)。
　　 ③RT-PCR结果表明:IL-1βmRNA表达在烟雾吸入性损伤后第1d立即升高,损伤期第1、4d组IL-1βmRNA表达明显高于修复期第14、21d组,第4d组(1.75±0.31)与第14d组(0.75±0.33)比较有显著性差异(P＜0.01);COX-2mRNA表达在烟雾吸入性损伤后第1d升高,在第21d达到最高,修复期第14、21d组(COX-2mRNA表达明显高于损伤期第1、4d组,第14d组(1.86±0.31)与第1d组(1.03±0.26)比较有显著性差异(P＜0.01)。
　　 结论：通过建立烟雾吸入性损伤修复模型,观察IL-1β和PGE2的动念变化,发现IL-1β在损伤期水平明显上调,而PGE2在修复期水平更高,这说明IL-1β与PGE2可能与烟雾吸入性损伤修复过程中病理变化具有相关性,可能为临床上判断烟雾吸入性损伤修复过程不同阶段(损伤期、修复期)提供帮助。
　　 第二部分(体外实验)、IL-1β对气道成纤维细胞PGE2表达的影响
　　 目的:研究IL-1β对小鼠气道成纤维细胞PGE2表达的影响,以探讨其在吸入性损伤修复中的作用。
　　 方法：分离雄性昆明种小鼠的气道成纤维细胞细胞并体外培养,分别收集IL-1β作用后不同时间点和不同浓度的IL-1β作用后的培养上清液及细胞:采用ELISA法和western blot技术测定PGE2水平,COX-2、mPGES1、EP2与15-PGDH蛋白表达。
　　 结果：
　　 ①经IL-1β1ng/ml处理后不同时间点气道成纤维细胞培养上清液PGE2水平在8h(148.2±28.3pg/ml)、16h(267.6±45.4pg/ml)、24h(210.5±38.6pg/ml)、48h(198.7±36.5pg/ml)均显著高于各对照组(P＜0.01),其中16h水平最高;气道成纤维细胞COX-2表达在8h(0.478±0.029)、16h(0.672±0.047)、24h(0.617±0.036)、48h(0.593±0.034)均显著高于各对照组(P＜0.01),其中16h表达水平最高:气道成纤维细胞mPGES1的表达在8h(0.300±0.018)、16h(0.549±0.034)、24h(0.497±O.030)、48h(0.443±0.026)均显著高于各对照组(P＜0.01),其中16h表达水平最高;气道成纤维细胞EP2、15-PGDH的表达在8h、16h、24h、48h与各对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。
　　 ②不同浓度IL-1β处理气道成纤维细胞后,气道成纤维细胞培养上清液PGE2水平在IL-1β0.1ng/ml组(142.9±22.3pg/ml)、1ng/ml组(267.6±45.4pg/ml)和10ng/ml组(587.3±106.9pg/ml)均显著高于对照组(58.5±16.0pg/ml)(P＜0.01),并且这三组之间比较差异也有显著性(P＜0.01);气道成纤维细胞COX-2表达在IL-1β0.1ng/ml组(0.525±0.031)、1ng/ml组(0.672±0.047)和10ng/ml组(1.012±0.064)均显著高于对照组(0.309±+0.019)(P＜0.01),并且这三组之间比较差异也有显著性(P＜0.01);气道成纤维细胞mPGES1表达在IL-1β0.1ng/ml组(0.380±0.021)、1ng/ml组(0.549±0.034)和10ng/ml组(0.879±0.045)均显著高于对照组(0.199±0.012)(P＜0.01),并且这三组之间比较差异也有显著性(P＜0.01):气道成纤维细胞EP2、15-PGDH的表达在IL-1β0.1ng/ml组、1ng/ml组和10ng/ml组与对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。
　　 结论：前炎症介质IL-1β可上调气道成纤维细胞PGE2水平、COX-2和mPGES表达,而对EP2和15-PGDH的表达无影响,这表明IL-1β主要是通过COX-2和mPGES1的表达来影响PGE2合成,从而参与气道吸入性损伤修复过程。气道成纤维细胞可能是损伤修复过程中炎症介质的主要来源细胞之一。