人亲环素D的重组表达及融合蛋白的活性测定

摘要

目的:为了研究以亲环素D(cyclophilinD,CypD)蛋白为作用靶点来进行药物筛选,从而找到一种药物高通量筛选的方法,本实验拟构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1/CypD,体外提取纯化融合蛋白GST-CypD,并测定其氨基脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-prolylcis-transisomerases,PPIase)活性。
　　 方法:采用RT-PCR.法从7721细胞中扩增CypD基因的全长cDNA,将纯化后的cDNA与pMD18-T Simple Vector直接连接,连接产物转化大肠杆菌JM-109,经蓝白斑筛选,挑选白色克隆扩增、鉴定为重组质粒pMD18-T/CypD。pMD18-T/CypD和pGEX-4T-1分别用EcoR I、Sal I双酶切,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段,将两者连接后转化大肠杆菌,提取重组质粒pGEX-4T-1/CypD,进行酶切及核苷酸序列测序鉴定。将阳性克隆扩增并优化表达条件,采用亲和层析方法提取纯化融合蛋白GST-CypD。利用糜蛋白酶偶联法来测定融合蛋白中CypD的氨基脯氨酸顺反异构酶活性。
　　 结果:扩增出CypD的全长cDNA编码区,并重组到原核表达质粒载体pGEX-4T-1中,重组质粒pGEX-4T-1/CypD转化感受态大肠杆菌后,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出相对分子质量为66KD的融合蛋白,活性测定表明融合蛋白GST-CypD具有PPIase活性。
　　 结论:成功克隆了人CypD基因的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,提取纯化后获得有生物活性的融合蛋白GST-CypD,为进一步研究CypD蛋白通过调控mPTP开放,进而在细胞死亡的过程中所起的作用及其机制奠定了基础。