熊果酸对瘦素诱导的肝星状细胞TIMP-1、MMP-1mRNA表达及JAK2-STAT3信号转导通路的影响

摘要

背景:
　　 肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)受各种细胞因子的激活及转化是肝纤维化发生和发展的关键因素。通过阻断细胞因子的信号转导,来抑制HSC的激活、增殖,诱导活化的HSC凋亡,成为逆转肝纤维化的重要手段。瘦素是近年研究发现的一个重要促肝纤维化因子,它主要通过JAK-STAT信号转导通路激活HSC,促进HSC增殖并抑制其凋亡,调控细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)和基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)等的表达,引起肝纤维化。
　　 我们的前期体外研究发现熊果酸能抑制HSC增殖和诱导其凋亡；体内实验发现熊果酸能减轻DMN引起的大鼠肝纤维化,效果优于秋水仙碱；近期体外研究发现,熊果酸干预后能明显抑制NOX亚基Racl和p22Phox的mRNA表达及ROS的产生,且能抑制核因子-K B(Nuclear factor-KB,NF-K B)激活,从而诱导HSC凋亡。本研究将在前期研究结果的基础上,进一步观察熊果酸对瘦素诱导的肝星状细胞TIMP-1、MMP-1mRNA表达及JAK-STAT信号转导通路的影响,探讨熊果酸抗肝纤维化的分子机制。
　　 目的:
　　 观察熊果酸对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA、MMP-1mRNA表达的影响；观察熊果酸对瘦素诱导HSC-T6细胞内ROS产生及JAK2-STAT3活化的影响,探讨熊果酸抗肝纤维化的分子机制。
　　 方法：
　　 取对数生长期的肝星状细胞(HSC-T6)进行随机分组:瘦素组(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干预组、NAC(10mM)干预组、DPI(20uM)干预组、AG490(50uM)干预组、熊果酸(50uM)自身对照组和正常对照组。在药物分别作用HSC6h、12h、24h后,提取总RNA,采用RT-PCR法检测TIMP-1mRNA、MMP-1mRNA的表达；药物作用1h后采用荧光显微镜检测肝星状细胞内ROS水平；药物作用24h后采用免疫细胞化学术检测HCS-T6中p-JAK2,P-STAT3蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1、熊果酸对HSC-T6细胞TIMP-1mRNA表达的影响
　　 瘦素组6h TIMP-1mRNA的表达与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但作用12h、24h后的TIMP-1mRNA表达较正常对照组升高(均P<0.05)；熊果酸干预组12h、24h的TIMP-1mRNA表达明显低于瘦素组(均P<0.01),与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；NAC干预组、DPI干预组、AG490干预组12h、24h TIMP.1mRNA的表达也低于瘦素组(P<0.01或P<0.05),熊果酸干预组各时间点与NAC干预组、DPI干预组、AG490干预组间相比,差异无统计学意义(均P>0.05)；熊果酸自身对照组各时间点与正常对照相比差异无统计学意义(均P>0.05)。
　　 2、熊果酸对HSC-T6细胞MMP-1mRNA表达的影响
　　 瘦素作用HSC-T6细胞6h、12h、24h的MMP-1mRNA的表达较正常对照组明显降低(P<0.05或P<0.01)；熊果酸干预组6h、12、24h MMP-1mRNA的表达较瘦素组明显升高(均P<0.01),与正常对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05)；熊果酸干预组在24h的MMP-1mRNA表达高于NAC干预组的表达(P<0.05),在各时间点与DPI干预组、AG490干预组相比,差异无统计学意义(均P>0.05)；熊果酸自身对照组在各时间点与正常对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 3、熊果酸对瘦素诱导HSC-T6细胞产生ROS的影响
　　 瘦素作用HSC-T6细胞1h后DCF荧光强度较正常对照组明显增高,差异有显著统计学意义(P<0.01)；熊果酸干预组的DCF荧光强度较瘦素组明显降低(P<0.01)；NAC干预组、DPI干预组和AG490干预组的DCF荧光强度也低于瘦素组(均P<0.01)；但熊果酸干预组的DCF荧光强度低于NAC干预组(P<0.01),与DPI干预组和AG490干预组相比差异无统计学意义(均P>0.05),熊果酸自身对照组的DCF荧光强度稍高于正常对照组(P<0.05)。
　　 4、熊果酸对对HSC-T6细胞浆内P-JAK2蛋白表达的影响
　　 免疫细胞化学分析发现,HSC-T6细胞瘦素作用后胞浆表达p-JAK2蛋白的阳性细胞数明显增多,与正常对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)；熊果酸干预组、NAC干预组和DPI干预组的p-JAK2蛋白表达低于瘦素组(P<0.05或P<0.01),但高于正常对照组的表达水平(均P<0.01)；AG490干预组的p-JAK2蛋白表达显著低于瘦素组(P<0.01),而且低于正常对照组的表达水平(P<0.05),熊果酸自身对照组的p-JAK2蛋白表达低于正常对照组(q P<0.01)。
　　 5、熊果酸对HSC-T6细胞核内p-STAT3蛋白表达的影响
　　 免疫细胞化学分析发现,HSC-T6细胞瘦素处理过后细胞核内表达p-STAT3蛋白的阳性细胞数明显增多,与正常对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)；熊果酸干预组的p-STAT3蛋白表达显著低于瘦素组(P<0.01),与正常对照相比差异无统计学意义(P>0.05)；NAC干预组和DPI干预组的p-STAT3蛋白表达也低于瘦素组(P<0.01),但高于正常对照组的表达水平(均P<0.01)；AG490干预组的p-STAT3蛋白表达显著低于瘦素组(P<0.01),与正常对照相比差异无统计学意义(q值=1.80,P>0.05):熊果酸干预组的p-STAT3蛋白表达低于NAC干预组和DPI干预组(P<0.05),与AG490干预组相比差异无统计学意义(P>0.05)；熊果酸自身对照组的p-STAT3蛋白表达与正常对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.熊果酸可以下调TIMP-1mRNA的表达、上调MMP-1mRNA的表达。
　　 2.瘦素能诱导HSC-T6细胞内ROS的产生,生成的ROS可能参与了JAK2-STAT3的活化,熊果酸干预能抑制瘦素诱导的ROS产生。
　　 3.瘦素可以激活HSC-T6细胞内的JAK2-STAT3信号转导通路,熊果酸的干预能抑制瘦素诱导的JAK2-STAT3活化。
　　 4.熊果酸对TIMP-1 mRNA及MMP-1 mRNA的表达的调控可能与抑制细胞内ROS的产生,从而抑制JAK-STAT信号转导通路的激活有关。