叶酸-壳聚糖siRNA纳米复合物抗肿瘤细胞乙酰肝素酶的靶向性研究

摘要

目的：根据人乙酰肝素酶(heparanase，HPA)的基因序列(cDNA)设计合成并筛选出有效的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。用siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞，检测乙酰肝素酶的表达情况，以筛选出能够有效干扰乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达的siRNA片段。通过侵袭转移实验来检测siRNA的抗肿瘤侵袭转移作用，为研发抗肿瘤侵袭转移药物提供理论基础。另外，以壳聚糖为材料包裹siRNA，并偶联特异性的肿瘤细胞靶向分子叶酸，通过叶酸与细胞表面叶酸受体结合，提高siRNA的输送效率，实现安全有效的靶向性基因治疗。
　　 方法：委托上海吉码制药技术有限公司合成siRNA片段。用lipo2000包裹不同浓度的带有荧光标记的FAM-siRNA转染MCF-7细胞，检测其转染效率。把实验分为6组，实验重复3次。①阳性对照组(Positive control orβ-actin，PC)；②阴性对照组(Negative control，NC)；③siRNA片段Ⅰ；④siRNA片段Ⅱ；⑤siRNA片段Ⅲ；⑥control组。以lipo2000为载体，采用瞬时转染法转染MCF-7细胞，通过RT-PCR和Western Blot筛选出有效干扰乙酰肝素酶的mRNA及蛋白表达的siRNA片段。通过MTT法分别检测转染了24h、48h和72h后的MCF-7细胞的增殖情况。叶酸偶联壳聚糖，通过制备的叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应，获得叶酸偶联壳聚糖(FA-CS)；采用红外光谱法验证偶联是否成功，紫外分光光度法测定偶联比。然后用偶联了叶酸的壳聚糖与siRNA制备成FA-CS-siRNA纳米复合物。测定纳米复合物粒径和形态及其包封率。转染：分别以control组、FA-CS组、FA-CS-siRNA纳米复合物组、CS-siRNA组和lipo2000-siRNA组进行转染，于48h提取总RNA通过RT-PCR检测其mRNA表达情况，于72h提取蛋白质通过Western Blot检测其乙酰肝素酶表达情况。肿瘤细胞侵袭实验分成lipo2000-siRNA组，FA-CS-siRNA纳米复合物组和阴性对照组。把转染后继续培养了24h的细胞接种于铺了Matrigel基质胶的培养小池中，继续培养24h后，显微镜下观察细胞穿膜情况，染色并计数。
　　 结果：⑴不同浓度的FAM-siRNA转染MCF-7细胞，表现出不同的转染效率。当FAM-siRNA浓度为80nM/L和100nM/L时，转染效率比较高。⑵3个siRNA片段都不同程度地下调乙酰肝素酶mRNA的表达，其中siRNA片段Ⅰ效果最明显。⑶红外光谱确认叶酸已成功与壳聚糖偶联。⑷FA-CS-siRNA纳米复合物的粒径为197.7nm，形态为圆型，分布较均匀。⑸FA-CS-siRNA纳米复合物组能有效地干扰MCF-7细胞中乙酰肝素酶的表达。其干扰效率高于CS-siRNA组，接近于lipo2000-siRNA组。⑹肿瘤细胞侵袭实验显示lipo2000-siRNA组和FA-CS-siRNA纳米复合物能有效抑制MCF-7细胞的侵袭和转移。
　　 结论：①不同浓度组FAM-siRNA转染MCF-7细胞显示，80nM/L和100nM/L这两个浓度的转染效率比较好且结果很接近。因此后续实验采用80nM/L的siRNA作为转染浓度。②siRNA片段Ⅰ能有效干扰MCF-7细胞乙酰肝素酶的表达，并有效地抑制了MCF-7细胞的侵袭和转移，因此选择siRNA片段Ⅰ用于后续实验。③制备了粒径较小的FA-CS-siRNA纳米复合物，并可做为siRNA的传递载体有效转染MCF-7细胞。④FA-CS-siRNA纳米复合物能有效干扰MCF-7细胞中乙酰肝素酶表达。其效率高于CS-siRNA组，接近于lipo2000-siRNA组。