缺氧环境下BMSCs促进VECs增殖和血管形成

摘要

目的：
　　 观察成人骨髓间充质干细胞在体外缺氧环境下对人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成能力的影响并探讨其可能机制，为干细胞更好的应用于临床上缺血缺氧性疾病的治疗提供理论依据。
　　 方法：
　　 收集成人骨髓血，密度梯度离心法收集分离BMSCs并进行体外扩增培养，传至第4代用于实验；流式细胞技术鉴定BMSCs表面标志物。
　　 收集BMSCs常氧环境(氧浓度为21％)下培养24h和缺氧环境下(含1％O2，5％CO2和94％N2的混合气体环境)培养24h后的细胞上清液即条件培养基。HUVECs传代培养后分成3组进行实验：对照组、BMSCsCMN-HUVECs组和BMSCsCMH-HUVECs组，各实验组细胞于缺氧环境下用含不同条件培养基的培养液培养，体外血管形成实验分析3组HUVECs在Matrigel上管腔样结构形成情况，并进行量化比较；MTT检N3组HUVECs增殖能力。
　　 BMSCs在缺氧环境下培养0h、12h、24h和48h后，RT-PCR检测细胞内SDF-1和VEGF的基因表达情况，0h为对照组，12h、24h和48h为实验组；ELISA法检测细胞上清液中SDF-1和VEGF的蛋白含量。
　　 结果：
　　 1.人BMSCs传至第4代呈旋涡状长梭形即纤维母细胞样生长；对数生长期的HUVECs多为多角形或短梭形，呈”铺路石”样排列生长
　　 2.人BMSCs阳性表达CD29、CD44和CD90，而阴性表达CD34、CD45和CD106
　　 3.BMSCsCMH-HUVECs组管腔样结构多于对照组和BMSCsCMN-HUVECs组。[14±2.3与3±0.59；14±2.3与5±1.1，P<0.05]
　　 4.不同缺氧时间点(12h，24h和48h)BMSCsCMH-HUVECs细胞增殖能力均显著高于对照组和BMSCsCMN-HUVECs组。[0.54±0.053与0.33±0.041，0.68±0.091与0.42±0.048，0.72±0.106与0.49±0.074；0.54±0.053与0.31±0.041，0.68±0.091与0.43±0.071，0.72+0.106与0.51±0.086，P<0.05]
　　 5.不同缺氧时间点(12h，24h和48h)BMSCs的SDF-1和VEGF基因表达水平均显著高于对照组。[VEGF：0.718±0.048 vs0.532±0.081，0.922±0.104 vs0.532±0.081，0.843±0.092 vs0.532±0.081；SDF-1:0.569±0.091 vs0.361±0.035，0.701±0.046 vs0.361±0.035，0.695±0.074 vs0.361±0.035，P<0.05]
　　 6.BMSCsCMH中SDF-1和VEGF蛋白含量均明显高于BMSCsCMN。[SDF-1：(4.52±0.44)ng/106cells与(1.37±0.09)ng/106cells；VEGF：(7.94±0.89)ng/106cell与(2.75±0.23)ng/106 cells，P<0.05]。
　　 结论：
　　 1.缺氧环境下收集的条件培养基即BMSCsCMH显著提高HUVECs增殖和在Matrigel上管腔样结构形成能力；
　　 2.缺氧显著上调BMSCs的SDF-1和VEGF基因表达，并促进二者大量分泌至细胞上清液中发挥作用；
　　 3.成人BMSCs在缺氧环境下通过旁分泌SDF-1和VEGF提高血管内皮细胞增殖活性和管腔样结构形成能力，促进血管新生。