慢病毒载体介导的Il-10诱导小鼠骨髓来源耐受性树突状细胞的形成

摘要

目的：探索体外培养小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(immature dendriticcells，imDCs)的实验条件和方法。探讨重组IL-10慢病毒载体转染小鼠imDCs，构建高分泌IL-10的耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，Tol-DCs)的可行性。
　　 方法：无菌条件下体外分离获得小鼠骨髓来源单核细胞，通过低剂量重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmlL-4)联合诱导并经CD11c免疫磁珠分选的方法获得小鼠imDCs，取部分细胞加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激诱导为成熟树突状细胞(mature dendritic cells，mDCs)。倒置显微镜下观察DC形态变化，流式细胞术分析比较imDCs和mDCs的表型差异。IL-10重组慢病毒载体转染小鼠imDCs，同时设计GFP慢病毒转染DC阳性对照组和未转染DC阴性对照组，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，通过ELISA法检测各组转染细胞的IL-10表达情况。将IL-10重组慢病毒转染imDCs和未转染imDCs分别行混合淋巴细胞反应，观察T淋巴细胞增殖情况，然后分别取反应细胞与刺激细胞比例为1:10的细胞混合液，同时设计未加imDCs的单一T细胞阴性对照组，行流式细胞术分析三组调节性T细胞比例的变化。
　　 结果：利用低剂量rmGM-CSF和rmlL-4联合诱导小鼠骨髓来源前体细胞并经CD11c免疫磁珠分选的方法，获得了大量高纯度的imDCs，细胞随培养时间的延长表现出典型的树突状形态，流式细胞术结果显示imDCs与mDCs比较，细胞表面MHCⅡ、CD80、CD86因子表达水平均显著低于后者。IL-10慢病毒转染imDCs后，荧光显微镜下观察细胞GFP高度表达，ELISA结果显示IL-10转染DC组的IL-10表达水平明显高于GFP转染组及未转染空白对照组(P<0.001)，GFP转染组与空白对照组均低水平分泌IL-10，之间无明显差异(P=0.997，>0.05)。混合淋巴细胞反应及流式细胞术结果分别提示imDCs经IL-10重组慢病毒转染后其刺激T细胞增殖能力减弱(P<0.01)，而调节性T细胞比例得到提高(P<0.01)。
　　 结论：采用低剂量GM-CSF和IL-4细胞因子联合诱导小鼠骨髓单核细胞的方法，获得了低表达共刺激因子的未成熟树突状细胞。将IL-10重组慢病毒载体转染小鼠未成熟树突状细胞，所转导的IL-10基因在未成熟树突状细胞内高效、稳定地表达。基因修饰后的未成熟树突状细胞具有促进调节性T细胞增殖和抑制T淋巴细胞增殖的致免疫耐受特征。