黄芪多糖对脑死亡状态下肝脏损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：观察脑死亡状态下及脑死亡至心脏死亡过程中的生命体征变化。探讨肝脏在脑死亡状态下的损伤情况及其发生机制。探讨黄芪多糖(APS)在家兔脑死亡至心脏死亡过程中对肝脏的保护作用及其可能机制。本实验分为两大部分
　　 第一部分：复制渐进性颅内加压脑死亡模型，观察诱导脑死亡及脑死亡至心脏死亡过程中的生命体征变化。
　　 方法：采用健康成年新西兰兔12只，雌雄不拘，体重(2.8±0.3)Kg，随机分为假手术组(C组)、脑死亡4h组(B1组)及脑死亡8h组(B2组)，每组4只。C组气管插管，股动静脉穿刺置管；钻孔颅内置Foley球囊导管，但不加压，麻醉8h。B1、B2组加压复制脑死亡模型后分别维持4h、8h，监测脑死亡建立过程中MAP、HR、RR变化及停止抢救后向心脏死亡过程中MAP、HR值变化，记录撤除抢救措施至心脏死亡时间。
　　 第二部分：脑死亡状态对肝脏功能与形态的影响及其机制，黄芪多糖对脑死亡家兔肝脏的保护作用。
　　 方法：健康成年新西兰兔24只，雌雄不拘，体重(2.8±0.3)Kg，随机分为假手术组(C组)、脑死亡组(B组)、黄芪多糖(APS)保护组(S组)，每组8只。B、S组运用渐进性颅内加压脑死亡模型，诱导脑死亡；C组，钻孔颅内置Foley球囊导管，但不加压，其他同B、S组。S组为黄芪多糖干预的脑死亡组，于麻醉后即刻经股静脉推注注射用黄芪多糖(APS)12mg/kg。C组假手术后4h(T1)，B组与S组诱导脑死亡后4h(T1)随机抽4只新西兰兔取标本，另4只新西兰兔于假手术后8h(T2)及诱导脑死亡后8h(T2)取标本。股动脉抽取血液标本5mL并切取肝脏组织冻存备检。检测血清急性肝损指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清TNF-α。HE染色观察肝组织病理学改变，免疫组织化学技术检测肝组织NF-κB p65蛋白的表达情况。运用逆转录PCR(RT-PCR)法检测肝组织ICAM-1 mRNA的转录水平。测定T1肝组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性。
　　 结果：第一部分：脑死亡组颅内加压后，平均动脉压明显上升(p<0.05)；脑死亡组BD2h后HR较加压前明显下降(p<0.05)；脑死亡组加压后RR较加压前上升(p<0.05)；脑死亡组在停止抢救后0.5min、3min、6min时MAP、HR均低于对照组，差别有统计学意义；停止抢救后，B1组与B2组心脏存活时间，差别无统计学意义。
　　 第二部分：1、血清ALT、AST、TNF-α水平：C组T1、T2三指标无显著性差异(P>0.05)。B组、S组相同时间点均显著高于C组(P<0.05)。B组T2各指标显著高于T1(P<0.05)。S组T2 ALT、TNF-α水平显著高于T1(P<0.05)，AST两时间点差异不显著(P>0.05)。S组各时间点三指标均显著低于B组(P<0.05)。
　　 2、免疫组化检测肝组织NF-κB p65蛋白表达：采用图像定量分析软件测量平均光密度值(OD)对免疫组化结果进行定量分析。3组NF-κB p65蛋白T1表达水平相似，相对较弱，OD值无显著性差异(P>0.05)。B组、S组T2表达较T1明显增强(P<0.05)。C、S组各组内OD值T1、T2无显著差异(P>0.05)。B组表达T2较T1显著性增强(P<0.05)。S组相应时间点蛋白表达量均低于B组(P<0.05)。
　　 3、RT-PCR：ICAM-1 mRNA转录水平，C组各时间点无显著性差异(P>0.05)；B、S组T2表达均强于T1(P<0.05)。3组对应时间点转录水平亦有显著性差异(P<0.05)。
　　 4、T1时S组肝组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性较C、B组明显升高(P<0.05)。
　　 5、HE染色光镜下：C组肝脏组织结构正常。B组T2点肝细胞明显肿胀，排列紊乱拥挤，肝窦受压变窄，胞质疏松淡染呈网状，气球样改变，汇管区炎性细胞浸润。S组T2点肝细胞增大水肿，胞质疏松，少量炎性细胞浸润。
　　 结论：1、渐进式颅内加压诱导脑死亡后，通过呼吸机辅助呼吸及应用血管活性药物等措施，能较长时间维持脑死亡机体血流动力学稳定。脑死亡后，抢救措施得当可以使心脏功能长时间的不衰。停止抢救后，MAP、HR呈渐进性下降，短时间内即全部进入无心跳死亡(Non heart beating death，NHBD)。
　　 2、脑死亡状态下兔血清ALT、AST、TNF-α水平升高。肝脏组织粘附分子ICAM-1 mRNA的转录水平表达升高。肝组织中NF-κB p65蛋白的翻译水平增加。升高程度与脑死亡时间呈正相关。
　　 3、黄芪多糖可以确切降低肝脏组织NF-κB蛋白翻译、ICAM-1 mRNA表达水平，降低血清TNF-α含量，提高组织抗氧自由基T-SOD活性，使肝功能好转。
　　 4、黄芪多糖对脑死亡至心脏死亡过程中家兔肝脏具有保护作用其机制可能为通过多种途径抑制NF-κB参与特异性及非特异性炎性损伤。