厚朴酚键合硅胶液相色谱固定相的制备、评价及应用研究

摘要

中草药活性成分具有各种药理功效,广泛地应用于治疗疾病。然而,关于其分离功能的研发较少。中药原材料容易获得,其活性成分的天然化学结构中包含多个活性位点,这有利于其色谱功能的开发,从而避免复杂的合成和纯化过程。另外,由于中药活性成分具有抗菌功能,利用其制备的新型固定相,与传统改性硅胶固定相比较,具有更长的柱寿命,适合于长期分离尿液及其他生物样品。本文首次合成了厚朴酚键合硅胶固定相(magnolol-bonded silica stationary phase,MSP),采用不同的仪器方法对该固定相的化学结构进行表征。选取具有不同化学结构的溶质探针,比如常见的有机碱、有机酸及中性极性化合物,较系统地评价了该新型固定相的色谱性能。此外,还研究了该新型固定相在反相高效液相色谱中的保留机理。结果表明,厚朴酚键合硅胶固定相在分离芳香化合物时具有多功能分离能力,这得益于其拥有多个作用位点。这种新型分离材料有望于在工业色谱分离绿色产品中得到更大的应用。本文的主要研究内容如下:
　　 1.较系统地综述了近些年来关于天然产物色谱固定相的制备、保留机理及应用,探讨了天然活性成分作为固定相配体在高效液相色谱中的应用前景,以此作为厚朴酚键合硅胶新型固定相的研究理论基础。
　　 2.采用固液相表面连续反应法,首先制备γ-巯丙基硅胶(γ-mercaptopropyl bonded silica,MPSP),然后在自由基引发剂偶氮二异丁腈(azobisisbutyronitrile,AIBN)作用下,通过巯基.乙烯加成反应(thiol-enyl addition reaction)将异氰酸苯酯化厚朴酚化学键合到γ-巯丙基硅胶表面,经过后处理便得到厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)。采用傅里叶红外光谱、元素分析及热重分析,表征厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)的化学结构。结果显示,天然成分厚朴酚被成功地键合到硅胶表面,根据元素分析碳含量计算出硅胶表面的配体含量约为72μmol/g;由于大部分质量损失发生在300℃以上,故该固定相具有良好的热稳定性。在恒压下将厚朴酚键合硅胶(MSP)填入不锈钢色谱柱(4.6 I.d.×150 inln)中,作为高效液相色谱分析柱使用。
　　 3.以联苯为溶质探针,甲醇-水(60:40,v/v)为流动相,测得其在厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)中的保留时间为19.44 min,计算得到理论塔板数为16423.55块/米。采用Kimata等提出的方法,分别评价了该新型固定相的疏水性能、亲水性能、离子交换能力及立体选择性等各项基本色谱性能。结果表明,厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)具有良好的反相色谱性能,这点与传统十八烷基键合硅胶固定相(octadecylsilvl-bonded silica,ODS,C18)类似。与ODS相比,厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)与溶质之间可能形成多种作用力,比如疏水作用、氢键作用、偶极-偶极作用,π-π作用及立体效应等。显然,更好的选择性及分离效果得益于具有多位点作用的厚朴酚配体。
　　 4.为了研究厚朴酚键合硅胶固定相的分离能力和保留机理,在反相高效液相色谱条件下,以商业化十八烷基键合硅胶柱(octadecylsilyl-bonded silica,ODS,C18)为参照,选取了常见的易离子化的芳香胺、芳香羧酸及其他极性化合物,即11种苯胺、5种吡啶、8种苯甲酸、4种苯丙氨酸及12种苯酚作为溶质探针。实验结果显示,厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)不仅具有良好的反相色谱特性,而且是一种具有多作用位点的多功能色谱固定相。其对化合物的综合保留机理主要包括疏水性作用、氢键作用、偶极.偶极作用、π-π;作用及电子转移作用等。例如,与ODS相比,厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)在更短的时间内对芳香羧酸及苯酚类化合物表现出更好的分离效果。因此,厚朴酚键合硅胶固定相适用于对芳香羧酸及苯酚进行常规快速分析。
　　 5.为了探讨厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)在嘌呤、嘧啶、蝶呤及黄酮中的分析应用,实验选取了包括4种嘌呤、8种嘧啶、4种蝶呤及5种黄酮在内的多种生物药物作为极性样品代表。为理解这些生物药物在厚朴酚键合硅胶新型固定相(MSP)中的保留机理,在相同色谱条件下,采用商业化十八烷基键合硅胶柱(octadecylsilyl-bonded silica,ODS,C18)对这些化合物进行分离测试。实验发现,在简单流动相条件下,一些药物在厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)中表现出更高的选择性及分离效果。虽然没有对该固定相进行封尾处理,但是含氮类极性化合物(嘌呤、嘧啶、蝶呤)表现出基本对称的色谱峰型,这意味着具有多种作用位点的厚朴酚配体在分离时能够起到抑制硅胶表面残余硅醇羟基的活性作用。大部分药物在这两种固定相中的洗脱顺序一致,这说明疏水性作用在分离这些药物时发挥着重要作用,这点与反相色谱特性吻合。厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)在分离许多极性药物时能够提供除疏水性作用之外的其他作用位点,可以合理地解释这些化合物在该固定相上表现出更好的分离选择性行为。例如,在厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)中分离嘌呤、嘧啶及蝶呤时,除了疏水性作用外,氢键作用还发挥着重要作用。部分溶质分子(例如硫唑嘌呤、紫花牡荆素)能与厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)之间形成较强的π-π作用。这些多种作用,提高了厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)对上述药物的分离选择性。
　　 6.为了探讨厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)在药物分析中的应用,在反相高效液相色谱-质谱中,采用以甲醇和二次水为组成的简单流动相,考察了厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)对两种市售药品(亦可贴醋酸地塞米松粘贴片和中药厚朴)的分离及初步鉴定分析。研究结果表明,厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)可以实现对这两种药物的主要成分的分离,而这些主要成分可以借助电喷雾离子源质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS))进行初步鉴定分析。将厚朴酚键合硅胶固定相(MSP)应用到制备级色谱中,开发其分离提纯天然产物的潜能,尤其是对植物药用资源的药用活性成分提取纯化,或许有更加广阔的应用前景。
　　 7.在反相高效液相色谱条件下建立了一种测定复方氨酚甲麻口服液中愈创木酚磺酸钾、对乙酰氨基苯酚和咖啡因的方法。在以甲醇和水为组成的简单二元流动相条件下,这三种物质能够实现基线分离,实际样品分析和加标回收试验均取得了较为满意的结果。该方法简单方便,快速准确,能够满足实际样品的快速常规分析要求。