OATP1B1及CYP2C9基因多态性对氟伐他汀转运代谢影响的分子机制研究

摘要

背景:
　　氟伐他汀是第一个全化学合成的降胆固醇药物，是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，适用于原发性高胆固醇及原发性混合型血脂异常等疾病。CYP2C9为氟伐他汀体内代谢的主要亚酶，OATP1B1则是氟伐他汀进入肝细胞的转运体。研究显示CYP2C9和OATP1B1的遗传变异均直接影响其生理功能，那么此遗传变异是否造成氟伐他汀的代谢转运的变化，从而引起氟伐他汀疗效和副作用的改变，确实令人关注。故有必要围绕CYP2C9及OATP1B1基因多态性对氟伐他汀的代谢转运影响展开系统研究，为氟伐他汀的合理应用提供理论与实验依据。
　　目的:
　　本课题拟通过构建野生型及突变型CYP2C9重组酶，研究CYP2C9基因多态性对氟伐他汀代谢的影响;同时通过构建OATP1B1*5、*1a和*15重组质粒模型，研究OATP1B1基因多态性对氟伐他汀转运的影响。综合分析CYP2C9及OATP1B1基因多态性对氟伐他汀基于转运代谢影响可能引起的临床疗效的改变。更好的服务于临床个体化治疗。
　　方法:
　　1、摸索和建立氟伐他汀重组酶的生物样本处理和HPLC检测方法。
　　2、建立氟伐他汀在重组酶中的孵育方法。
　　3、氟伐他汀在不同基因型CYP2C9重组酶中体外酶促动力学分析。实验分为空白对照组、CYP2C9*1、CYP2C9*3重组酶组，通过温孵时间、重组酶浓度、底物浓度三个方面来考察氟伐他汀在野生型和突变体重组酶的代谢动力学特征。采用建立的HPLC法测定重组酶体系中氟伐他汀及其代谢产物的量，比较氟伐他汀在CYP2C9野生型与突变体之间的代谢动力学性质，并采用米氏方程比较氟伐他汀在野生型和突变体重组酶的代谢动力学参数VmaxKm、Clint等。
　　4、建立氟伐他汀HEK293T细胞的生物样本处理和LC-MS检测方法。
　　5、系统展开HEK293T、OATP1B1*5、*1a和*15细胞的培养、传代及MTT试验。
　　6、氟伐他汀在表达OATP1B1*5、OATP1B1*1a及*15的HEK293T细胞中吸收转运实验分中为空白对照组、OATP1B1*1a、OATP1B1*5与OATP1B1*15质粒组，通过按不同时间点考察对摄取过程的影响;通过按不同酶浓度点考察对摄取过程的影响;通过每组分别加入系列浓度的氟伐他汀，考察底物浓度对摄取过程的影响。采用建立的LC-MS法测定HEK293T细胞样本中氟伐他汀浓度，考察三种不同基因型质粒模型中氟伐他汀的摄取动力学过程及其动力学参数(Km、Vmax、CLint值)，分析两个突变位点对氟伐他汀转运的影响。
　　7、数据统计分析。统计分析采用SPSS12.0软件进行数据处理，所有数据均以平均数±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05为具有显著性差异，P＞0.05为无显著性差异，P＜0.01为具有极显著性差异。
　　结果:
　　1、建立的HPLC检测方法完全能够符合重组酶样品的分析测试的要求，具有高灵敏度。定量下限为0.5uM。
　　2、建立的氟伐他汀在CYP2C9重组酶中的孵育方法以及样品处理方法完全能够符合本课题的要求。此方法在多次实验中成功验证，已稳定建立。
　　3、CYP2C9*1酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为8.96±0.76 uM、11.2±2.11 pmol/min/pmol、1.25;突变型CYP2C9*3酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为1.91±0.32uM、0.81±0.02pmol/min/pmol P450、0.42，通过比较野生型CYP2C9*1和突变型CYP2C9*3重组酶的酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值，统计分析得出(P＜0.01)，说明突变型CYP2C9*3代谢氟伐他汀的活性明显小于野生型CYP2C9*1。
　　4、成功的建立了氟伐他汀细胞样品处理方法及细胞样品的LC-MS分析检测方法，具有高灵敏度和特异性。定量下限为1.0nmol/L。
　　5、HEK293T、OATP1B1*5及OATP1B1*15细胞生长良好，形态大小均一，边界轮廓清晰，胞浆透亮，可见细胞核。通过MTT试验确定氟托伐他汀在1-150uM范围内对HEK293T细胞毒性小。
　　6、OATP1B1*5-HEK293T对氟伐他汀摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为12.35±1.32uM、3.27±0.53pmol·min-1·mg-1protein、0.26; OATP1B1*15-HEK293T对氟伐他汀摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为18.21±1.72uM、6.88±2.01pmol·min-1·mg-1 protein、0.38; OATP1B1*1a-HEK293T对氟伐他汀摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为17.46±2.05uM、6.32±1.23 pmol·min-1·mg-1protein、0.36。通过比较摄取动力学参数，发现OATP1B1*1a与OATP1B1*5统计学分析(P＜0.05)，差异非常显著。结果表明OATP1B1*5基因对氟伐他汀的转运能力明显低于OATP1B1*1a野生型。
　　结论:
　　1、研究表明，CYP2C9*3（突变型）代谢氟伐他汀的能力较CYP2C9*1（野生型）明显减弱，提示CYP2C9的基因多态性对氟伐他汀的代谢转化影响显著;
　　2、研究表明，OATP1B1*5（突变型）对氟伐他汀的转运活性较OATP1B1*1a（野生型）降低，提示OATP1B1的基因多态性对氟伐他汀的转运功能影响确切;
　　3、实验结果提示，CYP2C9*3突变的患者服用氟伐他汀可因代谢减弱而血药浓度升高，毒副作用增加;OATP1B1*5突变的患者服用氟伐他汀可因作用靶点药物浓度降低而导致治疗失败，同时带来增高外周血药浓度而增加不良反应的可能;若上述代谢酶转运体突变于同一患者服用氟伐他汀时，其风险尤为令人堪忧。因此临床上应用氟伐他汀进行调血脂治疗时，须高度关注由CYP2C9和OATP1B1基因多态带来的安全有效性隐患。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 前言

1．1 引言

1．2 CYP2C9基因多态性对FV代谢的影响

1．3 OATP1B1基因多态性对FV转运的影响

第2章 FV在不同基因型CYP2C9重组酶中酶促动力学分析

2．1 材料

2．1．1 主要仪器与设备

2．1．2 主要药品与试剂

2．1．3 人重组CYP2C9酶

2．2 方法

2．2．1 主要溶液配制

2．2．2 FV代谢孵育方法

2．2．3 重组酶样品处理方法

2．2．4 FV及其代谢产物HPLC分析方法建立

2．2．5 不同CYP2C9重组酶代谢FV动力学参数测定条件的选择

2．2．6 统计分析

2．3 结果

2．3．1 HPLC方法学评价

2．3．2 FV在重组酶CYP2C9*1中酶促动力学

2．3．3 FV在重组酶CYP2C9*3中酶促动力学

2．3．4 人CYP2C9重组酶对FV代谢的酶动力学参数测定及比较

2．4 小结与讨论

第3章 FV在不同基因型OATP1B1质粒模型中的转运差异研究

3．1 材料

3．1．1 细胞株

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 主要药品与试剂

3．2 方法

3．2．1 溶液配制

3．2．2 HEK293T细胞培养生理条件

3．2．3 HEK293T细胞复苏传代冻存

3．2．4 慢病毒转染OATP1B1*1a质粒

3．2．5 慢病毒感染HEK293T细胞实验

3．2．6 OATP1B1*5、OATP1B1*1a以及OATP1B1*15细胞的培养

3．2．7 HEK293T细胞生长曲线的绘制

3．2．8 FV对HEK293T细胞毒性实验

3．2．9 细胞样品的处理方法

3．2．10 FVLC-MS分析方法

3．2．11 BCA法测定HEK293T细胞裂解液蛋白含量

3．2．12 FV在不同基因型OATP1B1的HEK293T细胞中的摄取实验

3．2．13 统计分析

3．3 结果

3．3．1 慢病毒滴度检测

3．3．2 质粒表达检测

3．3．3 感染预实验结果

3．3．4 慢病毒感染HEK293T细胞结果

3．3．5 HEK293T培养

3．3．6 OATP1B1*5、*1a及OATP1B1*15培养

3．3．7 HEK293T细胞生长曲线的绘制

3．3．8 HEK293T细胞裂解液蛋白曲线的绘制

3．3．9 FV的MTT实验结果

3．3．10 FVLC-MS方法学评价

3．3．11 FV在不同基因型OATP1B1细胞中摄取动力学分析

3．4 小结与讨论

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 基因多态性对氟伐他汀药代动力学和药效学的影响