淡水育珠蚌硫氧还蛋白和葡萄糖调节蛋白78的分子克隆及表达分析

摘要

本实验采用RACE PCR技术和巢氏PCR方法分别从褶纹冠蚌和三角帆蚌中克隆到硫氧还蛋白(Trx)和葡萄糖调节蛋白78(Grp78)基因的cDNA全长序列。通过荧光定量PCR技术分析了Trx在褶纹冠蚌血细胞、肝胰腺、鳃、外套膜和肌肉组织中的表达，以及PBS刺激和金黄色葡萄球菌刺激后其在褶纹冠蚌五种组织中的表达变化。利用半定量RT-PCR分析Grp78基因在三角帆蚌的五个组织中表达，以及冷、热休克诱导后Grp78基因在三角帆蚌的五个组织中表达变化。
　　 1、CpTrx基因序列1169 bp（登录号:KC209545），其中5'非编码区(UTR)长11bp，3'非编码区长840 bp，含有PolyA尾和典型的腺苷酸信号序列AATAAA，开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）长度为318 bp，编码105个氨基酸。预测蛋白质分子量为11.79 kDa，等电点为5.38，不含有信号肽。氨基酸序列中含有1个Thioredoxin结构域(T3-K104)，区域内包含一个保守的CGPC活化位点。序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌Trx与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的氨基酸序列一致性分别为56％和52％。预测的Trx空间结构由5个β折叠和4个α-螺旋组成，α-螺旋包围β折叠形成紧密的球形，这一结构与人的Trx空间结构相似。Trx mRNA在血细胞、肝胰腺、鳃、外套膜、闭壳肌中均有表达，在鳃中表达量最高，其次是肝胰腺。金黄色葡萄球菌刺激褶纹冠蚌后，与PBS相比，各组织中的Trx表达量上升，血细胞中12h达到最高点后逐渐降低，48h最低但仍比空白对照高;肝胰脏中12h到48h一直升高到最大;鳃中12h明显升高，并达到最大值，然后开始降低直至空白对照以下;外套膜中12h和24h的表达量逐渐降低，36h的表达量升高，达到最大值，48h的表达量再次降低至空白对照以下;闭壳肌中12h明显升高，并达到最大值，24h、36h、48h的表达量明显降低并至空白对照以下。
　　 2、HcGrp78基因cDNA全长为3721 bp，其中5'UTR长度为148 bp，3'UTR长度为1578 bp，包含1个AATAA加尾信号和一个多聚腺苷酸ploy(A)尾，开放阅读框长度为1995 bp，预测编码664个氨基酸。预测HcGrp78蛋白分子量为73.27kDa，理论等电点为4.99。N端有一段长度为22个氨基酸的信号肽(Met-Gla22)。第44-51个氨基酸、第232-245个氨基酸及第369-383个氨基酸为3个HSP70家族的签名序列(Signature sequence)，分别为IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSLL和VVLVGGSTRIPKVQQ.含有16个丝氨酸磷酸化位点和、8个苏氨酸磷酸化位点、4个酪氨酸磷酸化位点。序列同源性比较结果显示三角帆蚌Grp78与其他物种高度保守，同源性在92％以上。HcGrp78 mRNA在三角帆蚌肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和血细胞中均有表达。4℃冷刺激后，与正常温度20℃相比，在各组织中的表达量没有明显变化;40℃热休克诱导后，肝胰腺中的表达量显著提高，血细胞和鳃内的表达量增加也较明显，而肌肉内的表达量变化不明显。

目录

声明

摘要

缩略语表

第1章 引言

1．1 硫氧还蛋白系统

1．1．1 硫氧还蛋白还原酶

1．1．2 NADPH

1．2 硫氧还蛋白家族

1．3 硫氧还蛋白的研究进展

1．3．1 硫氧还蛋白的分子结构

1．3．2 硫氧还蛋白的生物学功能

1．3．3 硫氧还蛋白在在生物工程中的应用

1．4 葡萄糖调节蛋白78的研究进展

1．4．1 葡萄糖调节蛋白78的发现

1．4．2 葡萄糖调节蛋白78的结构

1．4．3 HSP70家族

1．4．4 葡萄糖调节蛋白78的生物学功能

1．4．5 影响GRP78表达的因素

1．5 本论文的研究目的和意义

第2章 褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及表达分析

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 菌株及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 褶纹冠蚌血细胞总RNA的提取

2．2．2 褶纹冠蚌SMART cDNA的合成

2．2．3 DH5α感受态的制备

2．2．4 CpTrx基因3’末端和5’末端cDNA扩增

2．2．5 CpTrx序列分析

2．2．6 CpTrx基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达

2．2．7 金黄色葡萄球菌刺激后CpTrx基因的表达

2．3 实验结果

2．3．1 褶纹冠蚌血细胞总RNA的提取

2．3．2 褶纹冠蚌Trx基因的cDNA全长

2．3．3 褶纹冠蚌Trx基因的序列分析及氨基酸推导

2．3．4 推导的褶纹冠蚌Trx蛋白与其他物种的同源性比较

2．3．5 基于Trx氨基酸序列构建26种动物的系统发育树

2．3．6 褶纹冠蚌Trx的空间结构

2．3．7 CpTrx基因的组织分布

2．3．8 金黄色葡萄球菌刺激后CpTrx基因在褶纹冠蚌各组织中的表达变化

2．4 讨论

第3章 三角帆蚌葡萄糖调节蛋白78基因克隆及分析

3．1 材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 菌株及试剂

3．2 实验方法

3．2．1 三角帆蚌血细胞总RNA的提取

3．2．2 三角帆蚌SMART cDNA的合成

3．2．3 HcGrp78基因3’末端和5’末端cDNA扩增

3．2．4 HcGrp78序列分析

3．2．5 冷、热休克诱导后Grp78基因的组织表达

3．3 实验结果

3．3．1 三角帆蚌血细胞总RNA的提取

3．3．2 三角帆蚌Grp78基因的cDNA全长

3．3．3 三角帆蚌Grp78基因的序列分析及氨基酸推导

3．3．4 推导的三角帆蚌Grp78蛋白与其他物种的同源性比较

3．3．5 基于Grp78氨基酸序列构建20种动物的系统发育树

3．3．6 冷、热休克诱导后Grp78基因的组织表达

3．4 讨论

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果