小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究

摘要

研究背景:
　　感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科常见疾病，研究证实其病理变化主要是耳蜗毛细胞及与其相连的螺旋神经元的缺失。同时也有研究显示哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元受损后再生十分困难。如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经节细胞，就有希望治愈感音神经性耳聋。2006年，日本科学家Shinya Yamanaka等通过导入Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4四个外源基因将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)。多项研究证实，iPSCs具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的分化能力，却可以避免ESCs的免疫排斥及伦理道德问题，因此我们将iPSCs在体外诱导分化为耳蜗毛细胞及螺旋神经元，为感音神经性耳聋的治疗的开辟新的道路。
　　研究内容和方法:
　　1.iPSCs的培养与鉴定:取小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，iPSCs接种于饲养层上胰酶消化传代，倒置显微镜下观察iPSCs生长状态，观察拟胚体(EB)形成能力，RT-PCR检测iPSCs多能性基因Oct4，Nanog，Sox2的表达情况。
　　2.iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养及其分化细胞的鉴定:分离小鼠耳蜗Corti氏器，将iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养。对分化细胞用毛细胞的标志物(MyosinⅦA，Math1，Calretinin，Espin)进行免疫组化鉴定。
　　3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养及其分化细胞的鉴定:分离小鼠耳蜗蜗轴，将iPSCs与耳蜗蜗轴共培养，对分化细胞用神经元的标志物(Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin,Vesicular glutamate transporter1(VGluT1))进行免疫组化鉴定。
　　结果:
　　1.成功建立稳定的iPSCs培养体系，iPSCs体外培养可形成EB。RT-PCR显示iPSCs表达多能性基因Oct4，Nanog，Sox2。
　　2.iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养18天后可得到表达毛细胞标志蛋白MyosinⅦA，Math1，Calretinin，Espin的细胞。
　　3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养18天后可得到表达神经元标志蛋白Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin，VGluT1的细胞。
　　结论:
　　本实验成功建立稳定的小鼠iPSCs培养体系;共培养方法可成功将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞。

目录

声明

论文说明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及细胞系

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验主要培养基和试剂的配制

2．1．4 实验主要仪器与耗材

2．2 实验方法

2．2．1 器材的准备

2．2．2 原代MEF的分离培养与冻存

2．2．3 MEF的复苏、传代及饲养层细胞的制备

2．2．4 小鼠iPSCs的复苏、传代培养及冻存

2．2．5 小鼠iPSCs的鉴定

2．2．6 小鼠iPSCs向内耳毛细胞及螺旋神经元诱导分化

2．3 统计分析

第3章 结果

3．1 MEF的形态学特点

3．2 小鼠iPSCs的生长特点

3．3 拟胚体的生长特点

3．4 细胞经共培养诱导后的形态学特点

3．5 诱导后细胞相关标志物的表达

3．5．1 内耳毛细胞诱导分化组毛细胞相关标志物的免疫学鉴定结果

3．5．2 螺旋神经元诱导分化组神经元相关标志物的免疫学鉴定结果

3．6 统计学分析结果

3．6．1 毛细胞诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析

3．6．2 螺旋神经元诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

附录 实验图片

攻读学位期间的研究成果

综述 干细胞向耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞诱导分化研究