RNAi沉默STIM1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的：基质交感分子1(stromal interaction molecule1，STIM1)是一种主要定位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，广泛表达于动物细胞及肿瘤细胞，其主要功能是侦测内质网中Ca2+浓度变化而调控SOCC形成钙释放激活钙通道，从而影响多种细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学功能。但关于STIM1与胃癌发生、发展相关性的研究至今尚未见报道，为此，本研究拟以胃癌SGC7901细胞为研究对象，在细胞水平观察沉默STIM1对细胞内Ca2+信号以及胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响，为临床上胃癌的防治提供新思路及新靶点。
　　方法：采用LipofectamineTM2000脂质体将本实验室保存的STIM1干扰质粒pGPU6/shSTIM1和阴性质粒pGPU6/shSTIM1-NC瞬时转染SGC7901细胞。实验随机分为三组:空白对照组、阴性对照组、STIM1沉默组。转染48 h后，采用荧光显微镜观察转染效率;Western Blot测定STIM1蛋白的沉默效率;单细胞钙离子成像系统检测STIM1沉默后胞内Ca2+信号变化情况;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;流式细胞技术实验检测胃癌细胞凋亡及细胞周期变化情况。
　　结果：⑴pGPU6和pGPU6-shSTIM1质粒由脂质体介导成功转染胃癌SGC7901细胞，转染效率均达80％。⑵Western-blotting检测结果显示:空白对照组、阴性对照组、STIM1沉默组STIM1蛋白相对灰度值分别为0.73±0.03、0.69±0.02、0.29±0.05，STIM1沉默组与空白对照组及阴性对照组比较，沉默组STIM1蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)，而后两组比较无统计学差异(P＞0.05)。提示转染特异性STIM1-siRNA后可显著抑制STIM1蛋白表达水平。⑶单细胞Ca2+离子成像系统检测胞内钙信号结果显示:STIM1沉默组与空白对照组及阴性对照组比较，沉默组胞内Ca2+增加幅度明显降低（均P＜0.05），而后两组比较，胞内Ca2+增加幅度无统计学差异(P＞0.05)。⑷MTT实验结果显示:STIM1-siRNA抑制胃癌SGC7901细胞的增殖在24 h、48 h、72 h抑制率分别为37％、41％、27％，与阴性对照组比较，STIM1沉默组抑制率明显增加(P＜0.05)，且在转染48 h时抑制胃癌细胞增作用最明显。⑸流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:空白对照组、阴性对照组、STIM1沉默组胃癌细胞SGC7901凋亡率分别为7.95±0.08％、9.01±0.03％、36.98±0.13％，STIM1沉默组与空白对照组及阴性对照组比较，沉默组细胞凋亡率明显增加（均P＜0.05），而后两组间比较无统计学差异(P＞0.05)。⑹流式细胞仪检测细胞周期结果显示:各组胃癌细胞SGC7901培养48h后，空白对照组和阴性对照组胃癌细胞周期分布情况:G0/G1期为35.63±1.07％、S期为51.30±0.71％、G2/M期为13.14±0.81％;G0/G1期为37.46±0.67％、S期为50.89±0.87％、G2/M期为11.64±0.30％;沉默组胃癌细胞G0/G1期为62.38±0.91％、S期为29.53±0.71％、G2/M期为8.09±0.65％;沉默组胃癌细胞大多数处于G0/G1周期，而S期和G2/M期的水平明显下降，其SPF值、PI值明显小于空白对照组及阴性对照组（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组比较，SPF值及PI值无统计学差异(P＞0.05)。⑺体外迁移实验（Transwell实验）结果显示:空白对照组、阴性对照组、STIM1沉默组穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为44.67±1.53、41.00±2.02、14.50±2.29，沉默组与空白对照组及阴性对照组比较，沉默组穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显减少(P＜0.05)，而后两组间比较无统计学差异(P＞0.05)。提示沉默STIM1可明显抑制胃癌细胞SGC7901体外迁移能力。⑻体外侵袭实验结果显示:空白对照组、阴性对照组、STIM1沉默组穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为26.33±1.53、21.67±2.52、7.33±1.23，沉默组与空白对照组及阴性对照组比较，沉默组穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显减少(P＜0.05)，而后两组间比较无统计学差异(P＞0.05)。提示沉默STIM1可明显抑制胃癌细胞SGC7901体外侵袭能力。
　　结论：STIM1基因抑制后，胃癌细胞钙内流减少，增殖能力减缓、细胞周期阻滞于G0/G1期、凋亡率增加、迁移、侵袭能力减弱。表明STIM1是调控胃癌细胞增殖、迁移、侵袭过程中的重要蛋白。

目录

声明

摘要

中英缩略词表

第1章 引言

第2章 主要材料、仪器和试剂

2．1 主要材料

2．1．1 实验细胞来源及菌株

2．1．2 实验所用载体

2．2 实验仪器设备

2．3 主要试剂

2．3．1 主要试剂

2．3．2 主要试剂的配制

第3章 实验方法

3．1 细胞的培养及实验分组

3．1．1 实验用具处理

3．1．2 细胞复苏

3．1．3 细胞培养

3．1．4 细胞传代

3．1．5 细胞冻存

3．1．6 细胞计数

3．1．7 实验分组

3．1．8 质粒转染胃癌细胞SGC7901

3．2 Western Blotting实验

3．2．1 各组胃癌细胞蛋白的抽提

3．2．2 蛋白浓度测定

3．2．3 细胞蛋白样品的预处理

3．2．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3．2．5 Western Blotting检测实验

3．2．6 半定量分析

3．3 单细胞胞内Ca2+信号变化值检测

3．4 细胞增殖检测实验

3．5 Annexin-Ⅴ和PI双染色法流式检测细胞凋亡和坏死率

3．6 Annexin-Ⅴ和PI双染色法流式细胞仪检测细胞周期实验

3．7 细胞体外侵袭能力实验

3．8 细胞体外迁移能力实验

3．9 统计学分析

第4章 实验结果

4．1 胃癌细胞SGC7901 siRNA转染情况

4．1．1 荧光显微镜观察荧光转染效率

4．1．2 Western blotting检测蛋白干扰效率

4．2 单细胞钙离子成像系统检测胞内Ca2+变化情况

4．3 细胞增殖实验

4．4 Annexin-Ⅴ和PI双染色法流式检测细胞凋亡情况

4．5 Annexin-Ⅴ和PI双染色法流式细胞仪检测细胞周期

4．6 细胞体外迁移及侵袭能力实验

第5章 讨论

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 Stim1和Orai1在钙释放激活钙通道中的作用机制及研究进展