产朊假丝酵母高产谷胱甘肽及富硒工艺研究

摘要

谷胱甘肽具有重要的生理活性,对于肿瘤、癌症、抗衰老和内分泌失调的治疗有较明显的作用,广泛应用于在医药、食品、饲料等行业;硒对于人体有着维持人体正常生命活动的作用,缺硒会导致克山病、肝坏死、癌症等多种疾病的发生,硒主要以无机硒和有机硒的形式存在于自然界中,无机硒毒性较高,有机硒具有生物活性强、吸收率高、毒性低、环境污染小等优点。通过微生物发酵合成谷胱甘肽和硒的转化是目前最经济、安全、实用的方法。
　　本试验研究的内容及结论如下所示:
　　(1)研究了新铜试剂法测定酵母提取液中GSH含量的可行性,考察HPLC和新铜试剂法测定酵母提取中GSH含量。对2种方法所测得结果做了比较,结果表明:HPLC法测定,准确度、精密度、回收率、以及样品的测定值均能达到较高水平;新铜试剂法测定,准确度、回收率、以及样品的测定结果接近于HPLC法;由于新铜试剂法不可排除共存的其他含巯基化合物的干扰,其精密度要明显低于HPLC法。新铜试剂法适用于酵母提取液中GSH的测定,因酵母提取液中共存的其他含巯基化合物较少,其优点是操作简单,检测限低,测试成本较低,适用于大规模生产的分析测定。
　　(2)研究了培养基及培养条件对产朊假丝酵母发酵产 GSH的影响,考察了胞内 GSH的抽提方法、培养基组成及补加葡萄糖对 GSH产量的影响。结果显示:最佳的抽提方法为乙醇法;酵母粉与硫酸铵对胞内谷胱甘肽含量影响最大,以硫酸铵为氮源时 GSH含量可达到25.48mg/g;补加葡萄糖的时间为接种后10h、补加量为16mL。最佳条件下得到菌体干重为8.14g/L,通过摇瓶发酵GSH产量为113.45mg/L,GSH产量提高了2.89倍。
　　(3)研究了平板培养基中亚硒酸钠浓度对产朊假丝酵母菌株富硒能力的诱变情况。当平板培养基中添加亚硒酸钠时,菌株的颜色会变成红色,亚硒酸钠浓度越高颜色越深;在亚硒酸钠浓度超过1500mg/L时菌株的富硒能力达到最强,诱变后菌种富硒量是诱变前的5.6倍;利用选育的菌株进行实验,观察菌株数量与亚硒酸钠浓度的关系,结果表明产朊假丝酵母对亚硒酸钠的耐受力是有限的,当浓度超过50mg/L就会抑制菌体的生长。
　　(4)研究了发酵条件对产朊假丝酵母富硒量的影响。通过单因素的筛选,对酵母富硒量影响较大的三个因素为:亚硒酸钠浓度、初始pH及培养温度,以胞内总硒含量为响应值,利用响应面法对其进行优化。结果显示:在培养时间30h、加硒时间对数生长中期、亚硒酸钠浓度35mg/L,初始pH6.6、接种量10％、培养温度27℃、装液量150mL/500mL的条件下,得到的菌体生物量为6.87g/L;胞内总硒含量达到12639.7μg/L,硒含量为1839.8μg/g,其中亚硒酸钠转化率为79.1%,有机硒占90%以上;胞内实际总硒含量与数学模型理论值12518.8μg/L相差不显著,响应面法能较好的优化产朊假丝酵母富硒工艺条件。

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第1章 绪论

1.1 谷胱甘肽的概要

1.2 硒的概要

1.3 硒与谷胱甘肽的相互关系

1.4 高产谷胱甘肽酵母富集硒的研究

1.5 本课题研究内容及创新之处

第2章 新铜试剂法测定酵母提取液中GSH的可行性研究

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 分析检测方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第3章 产朊假丝酵母高产GSH发酵条件优化研究

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 分析检测方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第4章 产朊假丝酵母高富硒能力菌种的选育及耐硒能力研究

4.1 实验材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 分析测试方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第5章 响应面法优化产朊假丝酵母富硒工艺

5.1 实验材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 分析测试方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果