兼性厌氧产蛋白酶菌株的筛选及其发酵豆粕工艺研究

摘要

本论文以兼性厌氧、产蛋白酶为条件,筛选发酵豆粕优良菌种;对筛选菌株进行毒理性实验和蛋白酶相对酶活力的测定,并结合实验室保藏的植物乳杆菌 NCU116对豆粕发酵技术进行研究,跟踪分析发酵过程,确定最佳发酵工艺条件。
　　本文的主要研究内容与结论如下:
　　(1)优良发酵豆粕菌种的筛选与鉴定。在发酵豆粕、自然发酵的豆豉中筛选得到1株兼性厌氧、产蛋白酶菌株。经生理生化实验、分子生物学实验,确定其为甲基营养型芽孢杆菌,并命名为 NCU507。
　　(2)甲基营养型芽孢杆菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)的毒理性研究。首先对甲基营养型芽孢杆菌 NCU507生长曲线的进行测定,0~8 h, NCU507菌数迅速增加至9.1×107 cfu/mL(7.96 logCFU/mL);8 h~20 h,菌数缓慢增加,在20 h时达到最大,为4.8×108 cfu/mL(8.68 logCFU/mL);之后,菌数缓慢减少,40 h时减少至1.8×107 cfu/mL(7.26 logCFU/mL)。然后,测定 NCU507的细胞毒性,发现其在106 cfu/mL和107 cfu/mL时的加入量不会引起 Caco-2细胞膜结构的破坏,无细胞毒性。
　　(3)甲基营养型芽孢杆菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)的酶学性质研究。在不同的温度、pH、保温时间等因素的限制下测定蛋白酶的相对酶活力。结果表明,在40℃、pH为7.0时相对酶活力和酶的稳定性最高,Mn2+对酶反应促进作用最为明显。
　　(4)甲基营养型芽孢杆菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)单菌发酵豆粕工艺研究。单因素实验表明最佳发酵时间为96 h、最佳发酵温度为37℃、最佳接种量为4％、最佳料水比为1:1。.响应面实验优化结果表明最佳发酵温度36.8℃,最佳料水比为1:1.2,最佳发酵时间为85 h;在此条件下,理论可预测的水解度为26.24%。根据理论预测条件进行验证实验,结果显示其水解度为26.13%,与预测值接近,表明实验优化所得工艺条件可靠。
　　对单菌发酵豆粕过程动态分析,在前48 h内,菌数维持在大约8.85 log CFU/g;随着时间的增加,甲基营养型芽孢杆菌 NCU507的菌数逐渐下降。终点96 h时,下降至6.66 logCFU/g。总蛋白的含量逐渐上升。0 h时,初始总蛋白含量为47.68%(w/w),终点96 h时,总蛋白含量增加至52.90%(w/w)。小肽含量持续增加。在0 h~36 h内,小肽的含量迅速增加,由0.30%增加至21.40%(w/w),之后在36 h~96 h内,小肽的含量缓慢增加,终点96 h时,达到28.13%(w/w)。有机酸含量呈逐渐减少趋势,在0 h~24 h内,有机酸含量维持在0.49%(w/w),接着在24 h~72 h内迅速下降,在72 h时,有机酸含量降至0.15%(w/w);在72 h~96 h内,有机酸含量持续下降并逐渐降低至0%(w/w)。
　　(5)甲基营养型芽孢杆菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)与植物乳杆菌 NCU116混菌固态发酵豆粕工艺研究。单因素实验表明,NCU116与NCU507最佳接种比例为1:4、最佳总接种量为9%、最佳发酵时间为96 h、最佳料水比比例为1:1。响应面优化结果表明,最佳接种比例为5:1、最佳总接种量为7.50%、最佳料水比为1:1.2。此优化结果,理论可预测的水解度为26.52%。根据理论预测条件进行验证实验,结果显示其水解度的为26.37%,与预测值接近,表明实验优化所得工艺条件可靠。
　　对混菌发酵豆粕过程动态分析,植物乳杆菌 NCU116的加入使得甲基营养型芽孢杆菌 NCU507菌数的稳定期从48 h缩短为24 h,0 h~24 h时,NCU507的菌数维持在9.58 log CFU/g左右,然后在24 h~96 h内,迅速下降至4.72 log CFU/g; NCU116的菌数的稳定期时间较长,在0 h~48 h时一直维持在8.83 log CFU/g,然后在48 h~96 h内,下降至6.00 log CFU/g。总蛋白含量逐渐上升,终点96 h时,总蛋白含量为57.08%(w/w)。与单菌发酵相比,混菌发酵实验总蛋白含量上升了4.18%(w/w);小肽含量在整个发酵过程中呈上升趋势,终点96h时,豆粕中小肽含量达到26.78%(w/w),与单菌发酵相比,数值偏低。有机酸含量呈先上升,后下降,再稳定的趋势,且与单菌发酵相比,有机酸含量在整个发酵过程中维持较高水平。

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第 1 章 前言

1.1 豆粕的简介

1.2 微生物发酵豆粕研究现状

1.3 研究方案

第 2 章 兼性厌氧产蛋白酶菌株的选育

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第 3 章 甲基营养型芽孢杆菌 NCU507 的细胞毒性实验

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第 4 章 甲基营养型芽孢杆菌 NCU507 的蛋白酶酶学性质研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结论与分析

4.4 本章小结

第 5 章 单菌发酵工艺条件的优化

5.1 实验材料与设备

5.2 实验方法

5.3 结论与分析

5.4 本章小结

第 6 章 混菌发酵工艺条件优化

6.1 实验材料与设备

6.2 实验方法

6.3 实验结果与分析

6.4 本章小节

第 7 章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果