siRNA干扰成纤维细胞Caveolin-1基因表达对乳腺癌细胞增殖的影响及其机制探讨

摘要

研究背景及目的
　　乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,已经成为城市女性健康的第一杀手。人类对乳腺癌的相关研究已经取得很大进展,但是乳腺癌的发病诱因及影响因素非常复杂,目前对其发病原因和发病机制仍知之甚少。Caveolin-1蛋白是构成细胞胞膜窖(caveolae)的主要蛋白,它对聚集在caveolae的分子具有调控作用。Caveolin-1与乳腺上皮细胞转化和乳腺癌发生发展密切相关,正常情况下,Caveolin-1主要在乳腺基质成纤维细胞中表达丰富,而在慢性乳腺炎、乳腺纤维增生及其恶性转化微环境中的基质成纤维细胞Caveolin-1下降甚至阴性。临床Caveolin-1下降或阴性的乳腺癌病人,预后差,生存率低,乳腺癌晚期病人Caveolin-1均为阴性,而乳腺癌 Caveolin-1阳性的病人,预后好,生存率高,89％Caveolin-1阳性的乳腺癌患者在 l5年的随访时间内未发生复发。细胞自噬是真核细胞利用溶酶体对细胞器及蛋白质进行降解的生物学过程,自噬活性改变与多种疾病的发生发展有关,如炎症、细胞功能失调、神经变性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤和衰老等。肿瘤恶变微环境触发成纤维细胞上调自噬基因的表达可能是成纤维细胞异常激活事件,使成纤维细胞的自噬功能异常,如自噬自身产生的功能蛋白或结构蛋白,通过自噬降解大分子给癌前细胞补充营养,并通过自噬改变细胞的分泌功能,从而修饰微环境,导致微环境中细胞的遗传不稳定性及恶性选择,促进肿瘤的发生发展。
　　综上所述,本课题提出:在肿瘤微环境中,成纤维细胞内的Caveolin-1蛋白和自噬相关蛋白相互作用,从而参与调控成纤维细胞的转化和影响肿瘤细胞的发生和发展。
　　本课题建立成纤维细胞ESF及乳腺癌细胞BT474共培养模型,采用siRNA技术干扰Caveolin-1基因表达,探讨成纤维细胞Caveolin-1与细胞自噬之间的作用以及对乳腺癌细胞增殖的影响,期望能为乳腺癌的研究提供新的思路。
　　方法
　　1.脂质体介导转染,qRT-PCR和Westerm Blot方法检测外源性Caveolin-1特异性干扰RNA(siRNA Caveolin-1)介导成纤维细胞ESF的Caveolin-1转录后的基因干扰效应。
　　2. Transwell方法建立乳腺癌细胞BT474和成纤维细胞ESF共培养模型。
　　3. CCK-8方法检测ESF细胞Caveolin-1基因干扰和ESF/BT474共培养微环境对BT474细胞增殖的影响。
　　4.免疫荧光共聚焦激光显微镜观察 ESF细胞 Caveolin-1基因干扰和ESF/BT474共培养微环境对ESF细胞自噬体的影响,分析Caveolin-1与自噬体之间的关系。
　　结果
　　1. qRT-PCR和Western-Bloting实验结果显示,siRNA N.2实验组 Caveolin-1 mRNA表达水平显著低于其它各实验组(p<0.05),siRNA N.1组和siRNA N.3组分别与其它各组比较,Caveolin-1 mRNA表达水平也有显著差异(p<0.05)。siRNA N.1组、siRNA N.2组和siRNA N.3的 Caveolin-1蛋白表达水平显著低于对照组(p<0.05),表明siRNA有效地干扰ESF细胞表达Caveolin-1。综合qRT-PCR结果和Western blot结果,选择siRNA N.2实验组用于实验。
　　2.细胞增殖实验结果显示,48小时、72小时培养后,与各组比较, BT474/ESF+siRNA N.2共培养组BT474细胞增殖显著上调(p<0.05)。
　　3.免疫荧光共聚焦激光显微镜结果显示,① BT474/ESF+siRNA N.2共培养组自噬体显著高于其它各组自噬体(p<0.05),但该组 Caveolin-1表达则显著低于其它各组( p<0.05);② ESF单独培养组自噬体显著低于其它组自噬体(p<0.05),但该组 Caveolin-1表达则显著高于其它各组(p<0.05);③虽然ESF+siRNA N.2单独培养组自噬体和 Caveolin-1表达与其它各组有统计学意义(p<0.05),但远不如BT474/ESF+siRNA N.2共培养组自噬体上调以及Caveolin-1下调幅度大;④ BT474/ESF共培养组自噬体显著高于 ESF单独培养组和ESF+siRNA N.2单独培养组(p<0.05),但显著低于BT474/ESF+siRNA N.2共培养组( p<0.05), BT474/ESF共培养组 Caveolin-1表达显著高于BT474/ESF+siRNA N.2共培养组和ESF+siRNA N.2单独培养组,但是低于ESF单独培养组(p<0.05)。
　　结论
　　1.特异性siRNA Caveolin-1可有效发挥干扰Caveolin-1基因表达的作用。
　　2.成纤维细胞 Caveolin-1表达抑制可促进乳腺癌细胞增殖,乳腺癌细胞与Caveolin-1表达抑制的成纤维细胞共培养可加强乳腺癌细胞增殖。
　　3.成纤维细胞Caveolin-1表达抑制且其自噬体增加,二者之间为负相关。乳腺癌细胞与Caveolin-1表达抑制的成纤维细胞共培养促进自噬体与Caveolin-1的拮抗效应。

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英文缩略词

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 细胞培养及共培养模型建立

2.3 ESF细胞Caveolin-1-siRNA基因干扰模型建立和筛选、验证

2.4 CCK-8法检测乳腺癌细胞增殖

2.5 免疫荧光共聚焦激光显微镜观察成纤维细胞Caveolin-1和自噬体

2.6 统计学分析

第3章 实验结果

3.1 ESF细胞siRNA Caveolin-1基因干扰的模型建立

3.2 ESF细胞siRNA Caveolin-1基因干扰促进乳腺癌细胞的增殖

3.3 ESF细胞siRNA Caveolin-1基因干扰促进自噬体形成

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述