池蝶蚌性别决定相关基因feminization-1基因的分子特征及表达分析

摘要

本课题采用 Smart Race-PCR技术及巢氏 PCR技术从淡水贝类池蝶蚌中克隆到两个与性别决定相关的基因 feminization-1基因的 b、c两个亚型(Hsfem-1b、Hsfem-1c)的 cDNA全长序列。
　　Hsfem-1b基因的 cDNA序列全长为2072bp,其中5’ UTR(非编码区)长度为50bp,3’ UTR长度为114bp,具有28bp长的 polyA尾及加尾信号ATTAAA;开放阅读框(ORF)长度为1908bp,编码635个氨基酸组成的蛋白质;无信号肽,预测其分子量约为71.54kDa,理论等电点为6.05kD;HsFem-1b蛋白氨基酸序列 C端存在一段高度保守序列:Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His(X为随机氨基酸);SMART蛋白检测发现 Hsfem-1b基因编码蛋白的功能域包含8个 ANK(Ankyrin repeat motif)锚蛋白重复序列,并且运用 SWISS-MODEL Workspace预测 HsFem-1b蛋白的三维结构,与 SMART预测结果一致,能清楚的看到8个 ANK模体。
　　Hsfem-1c基因的 cDNA序列全长为2328bp,其中5’ UTR(非编码区)长度为137bp,3’ UTR长度为322bp,具有 polyA尾及加尾信号 AATAAA;开放阅读框(ORF)长度为1869bp,编码622个氨基酸组成的蛋白质;无信号肽,预测其分子量约为69.95kDa,理论等电点为7.05kD;HsFem-1c蛋白氨基酸序列 C端同样也存在一段高度保守序列:Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His(X为随机氨基酸);SMART蛋白检测发现 Hsfem-1c基因编码蛋白的功能域包含9个 ANK(Ankyrin repeat motif)锚蛋白重复序列,并且运用 SWISS-MODEL Workspace预测 HsFem-1c蛋白的三维结构,与 SMART预测结果一致,能清楚的看到9个 ANK模体。
　　利用 Q-PCR技术检测池蝶蚌不同组织 Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因的 mRNA表达情况。结果表明:Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因的 mRNA表达均存在明显的组织差异性。Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因都是在精巢组织中表达量最高,分别是肾脏的72.35倍、77.87倍。在肝胰腺、肠、卵巢中的表达量次之,在血淋巴、外套膜、鳃和闭壳肌中的表达量较低,肾脏中表达量最低。分析不同年龄层次池蝶蚌精巢中 Hsfem-1b和 Hsfem-1c的 mRNA表达,发现 Hsfem-1b和 Hsfem-1c基因随着精巢的发育,它们的表达水平变化趋势也不一样。随着性腺的成熟和精子的发生,Hsfem-1b基因的表达逐渐增强,说明它在池蝶蚌精子的发生或性腺发育的过程中具有重要的作用。Hsfem-1c基因在2龄池蝶蚌精巢中的表达量显著提高,是1龄的6.77倍;然而,在3~4龄时表达水平反而回落,至5龄时,表达水平又显著上升至1龄的7.67倍,与2龄表达水平相平。池蝶蚌在2龄时性腺细胞向精原细胞或卵原细胞方向发育,说明 Hsfem-1c基因可能参与池蝶蚌性腺细胞雄性性别分化的过程,并且可能与精子的发生有关。
　　通过双酶切连接,构建 pET32-HsFem-1b和 pET32-HsFem-1c原核表达载体,将测序正确的重组原核表达质粒转化至 Ecoi.li(DE3),IPTG诱导成功表达了两种融合蛋白。HsFem-1b重组蛋白以包涵体的形式存在,通过变性剂尿素溶解包涵体,梯度稀释法复性后根据 Ni2+螯和层析法原理纯化出单一的目的蛋白。HsFem-1c蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,直接通过镍柱纯化获得单一的目的蛋白。
　　利用纯化的重组 HsFem-1c蛋白制备兔多抗隆抗体,Elisa测出其血清抗体效价在512000以上,说明获得了较高效价的兔抗体血清。经 Western blotting检测发现重组 HsFem-1c蛋白可以与兔抗体血清特异性地结合。根据荧光抗体原理,通过制作冰冻切片,并利用获得的兔多抗血清在性腺细胞中定位 HsFem-1c蛋白的表达情况,发现 HsFem-1c蛋白主要在细胞内表达。

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本实验所需的器材及试剂

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第 1 章 前言

1. 性别决定与分化

1.1 哺乳类性别决定与分化

1.2 鸟类性别决定与分化

1.3 爬行类性别决定与分化

1.4 两栖类性别决定与分化

1.5 鱼类性别决定与分化

1.6 昆虫性别决定与分化

2．fem-1 基因的研究现状

3. 本课题研究的内容、目的及意义

第二章 池蝶蚌 fem-1 两个同源基因的 cDNA 全序列克隆及分析

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 池蝶蚌 Hsfem-1 基因在不同组织及不同年龄精巢中的表达分析

3.1 实验材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 Hsfem-1b 和 Hsfem-1c 基因的组织表达谱分析

3.1.3 Hsfem-1b 和 Hsfem-1c 基因的不同年龄段精巢表达谱分析

3.2 实验结果

3.2.1 总 RNA 提取

3.2.2 反转录效果检测

3.2.3 池蝶蚌 Hsfem-1b 和 Hsfem-1c 基因的组织表达谱分析

3.2.4 Hsfem-1b 和 Hsfem-1c 基因在池蝶蚌精巢中不同年龄段的表达分析

3.3 讨论

第四章 池蝶蚌 HsFem-1 蛋白原核表达及在性腺中的定位

4.1 材料与方法

4.1.1 质粒与菌株

4.1.2 引物设计

4.1.3 重组表达载体的构建

4.1.4 重组蛋白的表达及纯化

4.1.5 Bradford 法测定 HsFem-1c 重组蛋白浓度

4.1.6 多克隆抗体的制备

4.1.7 ELISA 间接法测定多克隆抗体效价

4.1.8 Western blot 检测 HsFem-1c 抗体特异性

4.1.9 HsFem-1c 蛋白在性腺中的细胞定位

4.2 实验结果

4.2.1 目的表达片段 PCR 扩增

4.2.2 阳性重组质粒的筛选

4.2.3 重组质粒双酶切鉴定

4.2.4 重组蛋白的诱导表达

4.2.5 融合蛋白溶解性分析

4.2.6 重组蛋白的纯化

4.2.7 纯化蛋白浓度的测定

4.2.8 ELISA 间接法测定多克隆抗血清效价

4.2.9 抗体特异性分析

4.2.10 HsFem-1c 蛋白在性腺组织中的定位

4.3 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 进一步的工作方向

致谢

攻读硕士期间的研究成果

参考文献