RNA干扰抑制小鼠CCR3基因对体内外嗜酸性粒细胞影响的作用研究

摘要

目的:
　　RNAi干扰下调小鼠CCR3基因的表达,在体内和体外观察嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)的变化情况,为阐明过敏性鼻炎的发生机制提供理论基础。
　　方法:
　　体外培养并纯化小鼠来源的EOS,用细胞染色法进行细胞鉴定。通过磷酸钙沉淀法,将体外合成的特异性CCR3shRNA重组慢病毒载体转染到EOS中。用RT-PCR和Western Blot蛋白印迹法检测慢病毒载体颗粒的抑制效果, Annexin V-FITC凋亡检测法((Annexin V-FITC Apoptosis Detection)进行流式细胞计数检测EOS凋亡情况。变应性鼻炎小鼠鼻腔局部分组注入慢病毒载体处理后,RT-PCR和Western Blot蛋白印迹法检测各组小鼠的骨髓、外周血及鼻腔黏膜中EOS的CCR3基因mRNA及蛋白的表达变化情况。流式细胞表面抗原直接标记法检测CD34+细胞的变化情况。
　　结果:
　　(1) RT-PCR和Western Blot表明CCR3shRNA重组慢病毒处理的EOS的CCR3基因在mRNA和蛋白水平表达降低,差异有统计学意义(p<0.05)。
　　(2)流式细胞凋亡术表明CCR3shRNA能够抑制EOS生长并促进细胞凋亡,差异有统计学意义(p<0.05)。
　　(3)在小鼠骨髓、外周血、鼻腔黏膜中,CCR3shRNA处理组的CCR3基因的mRNA及蛋白表达低于PBS治疗对照及shRNA治疗对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。
　　(4)CCR3shRNA处理组的CD34+细胞数与PBS对照及shRNA治疗组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。
　　结论:
　　RNAi干扰下调基因CCR3的表达,在细胞培养和变应性鼻炎动物模型中能有效的影响CCR3基因mRNA和蛋白水平的表达,同时能促进EOS凋亡。小鼠体内注入CCR3shRNA重组慢病毒能有效抑制EOS在局部组织的迁移及浸润。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 主要实验设备

2.2 实验材料

2.3主要试剂

2.4 主要溶液及试剂配制

2.5 实验方法与步骤

第3章 实验结果

3.1体外培养EOS的细胞鉴定

3.2 转染慢病毒的EOS的RT-PCR和Western Blot检测

3.3 EOS的流式细胞凋亡检测

3.4 动物标本的RT-PCR和Western Blot检测

3.5 动物模型的评分

3.6 鼻腔黏膜HE染色组织切片

3.7 EOS的CD34+表面抗原流式检测

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述