人剪切修复基因XPD对肝癌细胞中p53和Ets-1基因的作用

摘要

目的:
　　将野生型XPD基因通过质粒转入人肝癌细胞HepG2中,再加入p53抑制剂Pifithrin-α(PFT-α),观察基因XPD、p53、Ets-1的表达变化和对细胞增殖活力的影响。
　　方法:
　　1、复苏购买于美国模式菌种收集中心的人肝癌细胞HepG2,采用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培育、传代、冻存菌种;2、将含有pEGFP-N2空载质粒(N2质粒)(从美国Clontech公司购买)和pEGFP-N2-XPD重组质粒(XPD质粒)(由本实验室构建)的JM-109大肠杆菌的菌液,分别进行摇菌扩增;3、使用质粒提取试剂从菌液中分别提取N2质粒、XPD质粒;4、设置6个实验组,1组:空白对照组、2组:脂质体对照组、3组:pEGFP-N2组、4组:pEGFP-N2-XPD组、5组:pEGFP-N2-XPD+Pifithrin-α组、6组:Pifithrin-α组。5、使用瞬时转染技术,将质粒转染至细胞中,以空白组做对照,利用荧光显微镜,察看细胞中绿色荧光蛋白的表达,24h后加入p53抑制剂Pifithrin-α(PFT-α),在孵育24h后收集细胞;6、提取HepG2细胞总RNA,经过逆转录为cDNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中XPD、p53、Ets-1的mRNA表达变化;7、提取细胞总蛋白,用蛋白印记法(Western blot)检测XPD、p53、phospho-p53(ser-15)、Ets-1蛋白表达的变化。8、使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察HepG2细胞增殖的活力,流式细胞仪检测HepG2细胞周期变化。
　　结果:
　　1、转染N2空载质粒和XPD重组质粒后,在绿色荧光显微镜下,细胞表达出大量绿色荧光。2、利用RT-PCR方法检测mRNA表达,转染XPD重组质粒后,与空白对照组相比,XPD、p53的mRNA表达水平上升(P<0.01),Ets-1表达下降(P<0.01);在加入Pifithrin-α(PFT-α)后,与pEGFP-N2-XPD重组质粒组比较,Ets-1表达出现部分上升(P<0.01),XPD、p53没有明显变化。3、使用Western blot检测蛋白表达,转染XPD重组质粒后,与空白对照组相比, XPD、p53、p-p53蛋白表达水平增加(P<0.01),Ets-1蛋白水平下调(P<0.01);加入Pifithrin-α后,与pEGFP-N2-XPD组比较,p-p53蛋白表达明显下降,Ets-1出现上升(P<0.01),而XPD、p53没有明显变化。4、MTT法观察细胞,将XPD质粒转染至细胞后,增殖能力下降,加入Pifithrin-α(PFT-α)后出现部分上升(P<0.01)。5、流式细胞仪检测细胞周期显示,转染XPD质粒后,HepG2细胞进入S期发生阻滞,停滞在G1期,加入PFT-α后阻滞作用减弱。
　　结论:
　　将野生型XPD基因转染至HepG2细胞中,促使p53表达上调,同时抑制了原癌基因Ets-1的表达;加入p53抑制剂后,这种作用被部分逆转了,可以认为XPD的作用是通过p53来对Ets-1基因的表达进行调控的。转染野生型XPD基因后,肝癌细胞的增殖下降,细胞周期停滞,凋亡增加。这些研究均为肿瘤的基因治疗提供实验依据。

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中英缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株和质粒来源

2.1.2 主要试剂及产地

2.1.3 主要仪器设备及产地

2.2 实验方法

2.2.1 HepG2细胞的培养

2.2.2质粒的提取

2.2.3实验分组和转染加药

2.2.4 RT-PCR检测mRNA表达水平

2.2.5 Western blot检测蛋白表达水平

2.2.6 MTT法检测细胞增殖能力

2.2.7流式细胞仪检测细胞周期

2.3统计学方法

第3章 实验结果

3.1 质粒转染结果

3.2 mRNA表达水平

3.3 蛋白水平的表达

3.4 细胞增殖检测

3.5 细胞周期变化

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述