间充质干细胞诱导免疫抑制性中性粒细胞促肿瘤发展

摘要

目的:
　　研究小鼠骨髓间充质干细胞与中性粒细胞共培养后,中性粒细胞对T细胞免疫的影响,并探索其分子机制,以及共培养诱导后的中性粒细胞对小鼠4T1肿瘤进展的影响。
　　方法:
　　(1)通过体外分离培养与提纯小鼠骨髓间充质干细胞,骨髓中性粒细胞。
　　(2)通过体外共培养体系,Annexin-V-PI标记,流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡情况。
　　(3)体外共培养后中性粒细胞影响T细胞增殖实验:通过Anti-CD3抗体刺激T淋巴细胞增殖,并用CFSE检测其增殖率,同时检测部分T细胞激活Marker(CD25、CD69、CD62L、CD44)。
　　(4)采用基因芯片和RT-PCR研究处理组和未处理组转录水平情况。检测各组中性粒细胞精氨酸酶1活性水平。
　　(5)小鼠体内注射共培养的中性粒细胞与4T1小鼠肿瘤细胞建造肿瘤模型,记录肿瘤体积生长趋势。
　　结果:
　　(1)通过CD45、CD11b双阴选,CD11b、 Ly-6G双阳选分别能够得到所需间充质干细胞、中性粒细胞。
　　(2)共培养后中性粒细胞的生存时间更长,凋亡率减少。
　　(3)在体外经过MSC处理的PMN能够抑制T淋巴细胞的增殖和激活。
　　(4)共培养组精氨酸活性上调,转录水平上iNOS、 saa3、IL-10、IL-10R等免疫抑制基因上调。
　　(5)肿瘤模型示实验组4T1肿瘤体积增长比对照组迅速。
　　结论:
　　(1)在体外小鼠骨髓间充质干细胞能促进中性粒细胞的存活,减少凋亡。
　　(2)在体外经过共培养后的中性粒细胞,可能经Arginase1、iNOS介导抑制T淋巴细胞的分裂增殖反应。
　　(3)在转录水平上,共培养后的中性粒细胞与未处理组呈现较多差异, iNOS、saa3、IL-10、IL-10R等上调。
　　(4)小鼠4T1肿瘤模型示共培养后的中性粒细胞促进肿瘤进展。

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中英缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器

2.1.2 主要购买试剂

2.1.3 试剂配制

2.2 方法

2.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞原代分离与传代培养

2.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞提纯与鉴定

2.2.3 小鼠中性粒细胞的分离

2.2.4小鼠淋巴细胞的分离培养

2.2.5 MSC与PMN共培养，Annexin-V-PI检测PMN凋亡率

2.2.6 Anti-CD3刺激CFSE标记的T淋巴细胞增殖实验

2.2.7 4T1小鼠乳腺癌细胞模型建立：

2.2.9 Real-time RT-PCR验证；检测精氨酸活性

2.3 数据处理和统计学分析

第3章 结果

3.1 小鼠间充质干细胞的提纯与鉴定：

3.2与间充质干细胞共培养减少中性粒细胞的凋亡：

3.3共培养后中性粒细胞抑制T细胞增殖：

第4章 讨论

第5章 结论与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述