暴发性肝炎中活化的NKT细胞诱导免疫抑制性MDSC出现促炎效应及其相关机制的研究

摘要

肝脏作为一个天然免疫器官，一方面可以识别病原微生物和毒素，启动免疫应答以清除外来有害异物；另一方面，从小肠中吸收来的大量食物性外来的抗原从肝门静脉进入肝脏，常诱导机体对此类抗原的耐受，出现“门脉耐受”现象。因此，肝脏局部的免疫状态需要非常精细的调节，才能保证在特定的情况下正确选择是启动免疫应答还是诱导免疫耐受。目前发现一种抑制性细胞亚群——髓系衍生抑制性细胞(MDSCs)数量的变化与重症肝炎发生发展具有相关性：与正常小鼠相比，在重症肝炎小鼠脾脏、淋巴结和其它多种外周器官包括肝脏和肺中MDSC的数目增多。虽然在感染、创伤、肿瘤等的发生发展过程中MDSC被证明均参与其中并显著地抑制机体的免疫功能，但其在重症肝炎小鼠中免疫抑制功能未显示明显增强。值得注意的是肝脏中包含了众多的固有性天然免疫细胞，其中NKT细胞的比例远远高于其他免疫器官。而且相对于传统的T细胞，NKT细胞能在活化后1-2h内迅速的产生Th1型细胞因子(IFN-y和IL-2)和Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)。有研究发现NKT细胞能通过分泌IL-13来增强MDSC的抑制性活性，同时又发现活化的NKT细胞能促进具有免疫抑制性的MDSC分化成为具有免疫活性的APC。
　　 本研究通过给小鼠同时腹腔注射LPS和D-GalN，建立了小鼠重型肝炎模型，从而来探讨MDSC在重症肝炎的发生发展中是否参与重症肝炎的负向免疫调控作用，并研究NKT细胞是否对MDSC具有调节作用及其机制，以及MDSC对NKT细胞调节作用。小鼠在腹腔注射LPS/D-GalN后出现严重的肝脏损伤，血清中的AST和ALT水平的急剧上升，在6.5h时小鼠开始死亡，7-8h时大量小鼠死亡，到达9h时小鼠的死亡率达到100％。随着暴发性肝炎的进行性发展，MDSC在不同组织，包括了骨髓、脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中逐渐出现积累。同时观察不同亚群MDSC在正常或肝炎小鼠骨髓、脾脏和肝脏中的分布情况，发现单核系MDSC(Ly6G-Ly6Chigh)在骨髓、脾脏和肝脏中逐渐积累，而粒系MDSC( Ly6G+Ly6Clow)在骨髓中减少，但在脾脏和肝脏中出现了积累。在脾脏和肝脏中出现了积累在炎症部位(脾脏、肝脏)中积累的MDSC较骨髓中的MDSC表达更高水平的炎症性趋化因子如CCR2，CX3CR1，CXCR2，CD62L等。而且CXCR2的表达与粒系细胞相关，而CCR2和CX3CR1的表达与单核系细胞相关，所以这些趋化因子受体能诱导骨髓来源的MDSC向炎症部位趋化.并引起不同的MDSC亚群在不同组织器官中的积累。而且，在炎症部位(脾脏、肝脏)的MDSC较骨髓来源的MDSC表达更高水平的F4/80，MHCII，CD86，CD40和CDllc，以及更低水平的CD31和抑制性作用酶iNOS和Argl，并且其在抑制T细胞增殖和诱导Treg细胞的能力上较骨髓来源的MDSC有所减弱；与此相反的，脾脏和肝脏来源的MDSC产生更高水平的促炎症细胞因子(IL-6，TNF-α，IL-12p40和IFN-γ)，说明当MDSC在向炎症部位趋化并表现出向成熟髓系细胞分化趋势的同时，其免疫抑制作用降低，并出现促炎效应。值得注意的是，NKT细胞中细胞因子的产生与MDSC中STAT1和STAT6的活化相一致。并且相应的在6h，MDSC在骨髓中分化程度低并维持较高免疫抑制功能；而与此对应的是炎症部位MDSC出现向成熟髓系细胞分化趋势，并且其免疫抑制能力减弱，并出现促炎效应。根据以上结果我们推测炎症部位中出现的具有成熟分化趋势且免疫抑制功能降低的MDSC可能与NKT细胞的活性相关。体外实验结果进一步表明，在炎症部位中具有成熟分化趋势和促炎功能的MDSC的出现与NKT细胞的活化相关：与正常来源的NKT细胞比较，肝炎小鼠骨髓来源的NKT细胞能诱导MDSC产生大量的Argl和iNOS，并在一定程度上抑制MDSC的分化；而肝炎小鼠脾脏和肝脏来源的NKT与正常来源的NKT细胞比较，能抑制MDSC中Argl的产生，并诱导MDSC分泌一些炎症相关细胞因子如IL-12p40；而且相对于无NKT细胞共培养组，与炎症部位来源的NKT共培养的MDSC其抑制T细胞增殖的能力减弱。通过Transwell实验发现NKT细胞促进MDSC的分化成熟主要是通过细胞-细胞间直接接触来发挥作用的。
　　 为了研究炎症部位(如脾脏和肝脏)积累的出现成熟分化趋势和促炎作用的MDSC对于NKT细胞的作用，我们检测了肝炎小鼠中肝脏和脾脏NKT细胞的数量，发现NKT细胞比例出现不同程度的下调，且通过线性回归分析NKT细胞比例的减少与MDSC的增加具有一定程度的相关性。并通过体外实验证明MDSC能活化NKT细胞，并进一步诱导NKT细胞的凋亡，而且这个作用是细胞接触依赖的，主要通过Fas-FasL途径实现。综上所述，MDSC在急性重症肝炎小鼠不同器官中出现积累，其中一些趋化因子受体(如CCR2，CX3CR1，CXCR2，CD62L)能诱导骨髓来源的MDSC向炎症部位趋化，并引起不同的MDSC亚群在不同组织器官中的积累。在炎症部位，活化的NKT细胞能诱导MDSC出现分化和成熟，从而导致其免疫抑制功能的降低并出现促炎症的作用，而这些MDSC及其分泌的细胞因子又能进一步活化NKT细胞，并诱导这些活化的NKT细胞的凋亡。这些发现对于研究天然免疫细胞如NKT细胞和调节性细胞如MDSC在肝脏损伤中的作用有一定的提示，对于控制、治疗天然免疫细胞参与的肝脏疾病具有指导意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

致谢

1引 言

2材料与方法

3结果

3.1随着暴发性肝炎的进行性发展，MDSC及其亚群在不同组织中出现不同程度的积累

3.2 MDSC表达的趋化因子受体诱导MDSC向炎症部位趋化

3.3 MDSC向炎症部位趋化的同时表现出向成熟髓系细胞分化的趋势

3.4在炎症部位具有成熟分化趋势的MDSC的免疫抑制功能降低

3.5在炎症部位具有成熟分化趋势的MDSC出现促炎效应

3.6 MDSC的分化状态和免疫抑制能力与NKT细胞的活性相关，并且这些NKT细胞主要是通过细胞-细胞间直接接触来发挥作用

3.7炎症部位的MDSC能诱导NKT细胞的活化和凋亡

4讨 论

参考文献

综述 髓系衍生抑制性细胞与感染性疾病关系的研究进展

作者简历及在学期间发表的文章