葛根素抗心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用机制研究

摘要

目的:葛根素是一种葛根豆科植物中提取的黄酮苷类成分,研究表明:葛根素具有抗心肌缺氧复氧损伤的保护作用,属于药理学的研究热点。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε, PKCε)属于依赖磷脂的丝/苏氨酸激酶家族,其各种亚型参预了细胞凋亡等多种细胞内病理生理功能的调控,是重要的内源性心肌保护因子之一。本实验采用了新生Sprague-Dawley(SD)大鼠原代心肌细胞,成功地建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,探讨PKCε蛋白表达与葛根素抗心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用之间的关系。
　　方法:选取新生SD大鼠原代心肌细胞,随机分为五组,每组重复六次:(1)正常对照组(Con)、(2)缺氧/复氧组(A/R)、(3)葛根素+A/R组(Pue+A/R)、(4)葛根素+抑制剂+A/R组(Pue+εV1-2+A/R)、(5)抑制剂+A/R组(εV1-2+A/R)。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法测定实验各组细胞的存活率,Western blotting(免疫印迹)法测定PKCε蛋白表达水平,酶联免疫法测定各组细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸肌酶(CK)、细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和丙二醛(MDA)的含量,采用流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(Δψm)变化、细胞凋亡水平。
　　结果:葛根素预处理24h后,成功建立缺氧复氧损伤的心肌细胞中PKCε表达水平呈剂量依赖性上调(P<0.01),且与A/R组相比,320μM葛根素预处理组细胞存活率升高最显著,PKCε蛋白表达上调最明显;从细胞培养基收集的上清中可看出,CK和LDH活性下降,细胞内SOD、GSH-Px活性增强,MDA含量下降,细胞内ROS含量明显减少,线粒体膜电位稳定性增加,细胞凋亡量减少,与A/R组相比,均具有显著性差异(P<0.01);PKCε特异性抑制剂εV1-2的加入能显著削弱葛根素的抗缺氧复氧损伤的心肌保护作用。
　　结论:葛根素抗A/R损伤的保护作用依附于PKCε信号通路,至少部分地依赖于PKCε表达程度增加。

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英文缩写及全称和中文对照表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1主要材料及试剂

2.2实验主要仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 新生SD大鼠原代心肌细胞的培养

2.3.2葛根素预处理新生SD大鼠原代心肌细胞

2.3.3 采取MTT比色法检测细胞存活率

2.3.4 Western Blotting(免疫印迹)法检测原代心肌细胞中PKCε蛋白表达

2.3.5生化指标检测

2.4 处理数据

第3章 结果

3.1葛根素对新生SD大鼠原代心肌细胞A/R损伤后存活率的影响

3.2 葛根素对新生SD大鼠原代心肌细胞A/R损伤后PKCε蛋白的表达变化

3.3葛根素对新生SD大鼠原代心肌细胞A/R后乳酸脱氢酶(LDH)活和肌酸激酶（CK）活性的影响

3.4葛根素对新生SD大鼠原代心肌细胞A/R损伤后ROS生成的影响

3.5葛根素对新生大鼠原代心肌细胞A/R损伤后抗氧化物酶SOD、GSH-Px及MDA的影响.

3.6 葛根素对新生大鼠原代心肌细胞 A/R 损伤后线粒体膜电位的影响.

3.7葛根素对新生大鼠原代心肌细胞A/R损伤后细胞凋亡的影响.

第4章 讨 论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述