基于甘露糖受体的黑灵芝多糖免疫调节作用及机制研究

摘要

多糖被证实具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种功能，其中免疫调节作用是众多多糖类物质的最基本的作用，该调节方式主要通过以下几个途径实现：直接或间接激活巨噬细胞、NK细胞和T、B淋巴细胞；促进细胞因子的生成与分泌；激活补体系统；促进抗体产生等。近年来研究发现，多糖激活免疫细胞发挥免疫调节作用主要是通过与细胞表面的受体相结合而介导的。目前发现的受体主要包括Toll样受体（TLRs）、甘露糖受体（MR）、树突状细胞相关C型凝集素-1（Dectin-1）、补体受体3（CR3）、清道夫受体（SR）等。多糖与这些受体结合后可以激活细胞内信号通路，进而活化免疫细胞，促进细胞因子的释放调节免疫反应。MR可识别含甘露糖或岩藻糖残基的多种糖分子，是先天免疫系统中重要的模式识别受体和内吞受体，主要存在于巨噬细胞和树突状细胞的细胞膜表面，在维持内稳态、识别病原体、诱导细胞因子、抗原递呈等过程中发挥重要作用。TLRs则是目前所发现的受体中与多糖关系最为密切的一类。
　　黑灵芝既是我国传统的药用真菌也是民间常见的食品配料，它具有多方面的生物活性。本实验室从黑灵芝中分离纯化出一种水溶性多糖（PSG-1），综合现代化学分析方法，解析出了其结构特征，结果表明 PSG-1的单糖组成为甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩尔比为1：1.28：4.91。实验室前期研究已确定 PSG-1具有增强宿主免疫功能的作用，在此基础上开展 MR的研究对深入了解 PSG-1活性功能与免疫机制，以及基于 MR为靶向的黑灵芝的深度开发具有重要意义。因此，本实验探讨了PSG-1的免疫调节作用与MR的关系以及在LPS诱导的巨噬细胞中PSG-1激活的TLRs信号转导通路与MR的关系。主要研究内容如下：
　　1、PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞MR的影响：为了探讨PSG-1对正常小鼠腹腔巨噬细胞MR的影响，本实验将20～160μg/mL PSG-1作用巨噬细胞后，用流式细胞仪测定细胞表面MR的表达，RT-PCR检测巨噬细胞MR的mRNA表达水平；以MR抑制剂甘露聚糖预处理细胞30min后加入PSG-1，用流式细胞仪检测巨噬细胞的吞噬功能，酶联免疫法测定培养上清液中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β的含量，RT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平。结果显示PSG-1可上调巨噬细胞表面MR的表达及MR mRNA水平；与单独PSG-1处理组相比，甘露聚糖预处理可明显抑制 PSG-1增强的巨噬细胞吞噬功能和诱导细胞分泌IL-1β，对TNF-α的分泌则无影响。结论：MR能部分介导PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。
　　2、PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞MR的影响：为了探讨PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞 MR的影响，本实验采用流式细胞仪检测 PSG-1对LPS刺激的巨噬细胞表面MR的表达以及RT-PCR检测PSG-1对LPS刺激的巨噬细胞MR mRNA的表达水平的影响，结果证明在LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞炎症模型中，PSG-1对因LPS刺激下调的MR存在一定的上调作用。进一步用抗MR抗体处理LPS和PSG-1共同作用的巨噬细胞30min后，结果发现抗MR抗体可以升高PSG-1抑制的LPS诱导的巨噬细胞吞噬中性红的能力，且同时显著升高了PSG-1抑制的LPS诱导的巨噬细胞IL-1β的分泌及IL-1β mRNA的表达效应，但是却明显地降低了PSG-1促进的LPS诱导的巨噬细胞IL-10的分泌及IL-10 mRNA的表达效应，另外对PSG-1抑制的LPS诱导的巨噬细胞TNF-α的分泌及TNF-αmRNA表达效应则未显示出影响。结论：在LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞中，PSG-1对细胞的免疫调节作用有赖于MR的参与。
　　3、PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞 TLR2和TLR4的影响及其与MR在PSG-1介导的免疫调节作用中的关系：本实验采用Western Blot检测PSG-1对LPS刺激的巨噬细胞 TLR2和TLR4蛋白表达以及RT-PCR检测 TLR2和TLR4 mRNA表达水平的影响，实验结果表明在LPS刺激的巨噬细胞中，PSG-1可通过作用于TLR4调节巨噬细胞的功能。基于以上实验结果，综合考虑前两章结果中PSG-1对MR的影响，采用抗MR抗体封闭MR功能，进一步研究抑制MR的功能后是否能对TLR4所介导的信号途径产生影响。结果显示，LPS刺激的巨噬细胞中，TLR4的MyD88依赖途径被活化，细胞核内NF-κB p65的表达升高，细胞MAPKs的磷酸化水平也升高了；而加入高剂量PSG-1（160μg/mL）共同作用于细胞后，TLR4的表达被下调，核内NF-κB p65的高表达有所降低，MAPKs的磷酸化水平也同时受到了抑制，由此可知PSG-1的确作用于TLR4所介导的信号转导途径；当细胞预先加入抗MR抗体作用后，与LPS和PSG-1共同作用的细胞相比较，结果发现仅对细胞核内NF-κB p65由于PSG-1的作用而出现的表达降低有一定的回调作用，对其他分子的蛋白表达无明显的影响。结论：PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞的细胞核内NF-κB p65蛋白的表达可能受到TLR4和MR的共同调节。
　　综上所述，PSG-1可通过MR影响小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节功能以及在LPS诱导的巨噬细胞中TLR4与MR均参与了PSG-1介导的免疫调节作用且两者存在一定的相互作用关系。实验结果可为完善多糖存在的免疫调节分子机制提供理论依据，还可为拓展多糖的进一步研究方向提供思路。

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符号说明

第1章 绪论

1.1 多糖简介

1.2 多糖的免疫调节作用

1.3 多糖免疫调节作用的受体

1.4 本研究的目的、主要研究内容及创新性

第2章 PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞MR的影响

2.1 引言

2.2 仪器及试剂

2.3 材料及动物

2.4 实验方法

2.5 实验结果

2.6 讨论

2.7 本章小结

第3章 PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞MR的影响

3.1 引言

3.2 仪器及试剂

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章 PSG-1对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR2和

4.1 引言

4.2 仪器及试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 进一步工作方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果