池蝶蚌剂量补偿相关基因msl-1基因的分子特征及表达分析

摘要

本实验根据实验室转录组数据，首次运用Race-PCR及巢式PCR技术从淡水珍珠贝类池蝶蚌中获得一个剂量补偿相关基因msl-1（male-specific lethal-1）基因的cDNA全长序列，获得结果如下：
　　1、池蝶蚌msl-1的cDNA长度是3097bp，其中3’非编码区含1586bp，5’非编码区638bp，拥有一个29bp的polyA尾，并且含有多聚腺苷信号信号ATTAAA；它的开放阅读框为873bp，编码290个氨基酸；无信号肽。生物学软件预测其分子量约为33694.12Da，理论等电点为8.27；对其编码的蛋白结构域分析可知，在MSL-1的N端第166到297个氨基酸区域具有一个完整PEHE结构域，该结构域为MSL-1的特异性结构；通过二级结构预测可知，在MSL-1二级结构中，无规则卷曲和环形结构最多，其次为α螺旋结构(H)，β折叠结构(E)最少；通过N-J法绘制的系统进化树表明，池蝶蚌msl-1基因序列总体与其它动物的msl-1亲缘性较低，其中与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）msl-1的同源性最高为55％，其与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）和莲花青螺（Lottia gigantea）共一分支。2、Q-PCR结果发现msl-1基因在取材的全部池蝶蚌组织中表达，存在明显的组织差异性，并且在雄性性腺中表达相对最高，其次是在肾脏、肠中，在心脏中表达量最低；在不同年龄池蝶蚌性腺中的mRNA表达情况：雌性当中，msl-1基因在1龄中的表达量较少，2、3龄时略有上升之后回落，但是在4龄时出现表达量显著上升现象，且是1龄的6.48倍，在5龄时又有所回落，甚至略低于一龄时的表达量；在雄性中，msl-1基因在1、2龄的表达量较高且呈上升趋势，3～4龄的表达量则下降明显；至5龄时，表达量提高明显，并且远高于1、2龄的表达水平；此外，msl-1在雄性性腺中的表达量普遍高于同时期在雌性性腺中的表达量，但在4龄时雌性中的表达量却略高于雄性中的表达量。
　　3、通过连接原核表达载体，构建pEASY-msl-1重组载体，构建成功的重组载体转入E.coli(DE3)，使用半乳糖苷酶底物类似物诱导表达MSL-1融合蛋白。MSL-1重组蛋白主要在上清中存在，根据Ni2+螯和层析法原理纯化出单一的目的蛋白。纯化后的MSL-1重组蛋白免疫新西兰兔得到多克隆抗体，经过检测抗体效价在512000以上，同时Western blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有很好的生物学特异性；利用多克隆抗体对池蝶蚌性腺组织冰冻切片进行免疫荧光定位，发现MSL-1蛋白主要在核膜上表达。

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第一章 前言

1.1 剂量补偿简介

1.2 剂量补偿其他模式的研究

1.3 msl-1研究状况

1.4 本课题研究的内容、目的及意义

第二章 池蝶蚌msl-1基因的cDNA克隆及分析

2.1 材料与操作

2.2 结果

2.3讨论

第三章 msl-1基因在池蝶蚌不同组织中的表达

3.1 材料和操作

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 池蝶蚌MSL-1蛋白在性腺中的定位

4.1 材料与操作

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 进一步的工作方向

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果